研究背景和目的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是颅内最常见且恶性程度最高的原发性肿瘤,2005年Stupp报道GBM中位生存期为14.6个月,2年生存率26.5%,总体来说预后不佳。肿瘤细胞对术后标准放化疗的抵抗是导致预后不佳的主要原因之一。既往研究认为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase, MGMT)作为一种DNA修复酶,能够将TMZ等烷化剂造成的DNA分子中鸟嘌呤06位上增加的烷基转移至MGMT酶自身第145位半胱氨酸残基上,从而使得鸟嘌呤结构复原,DNA分子结构和功能修复,保护GBM肿瘤细胞免受替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)的损害。MGMT启动子甲基化后MGMT酶表达的沉默能使GBM患者预后更好,对TMZ敏感性更佳。但临床上仍然有一些MGMT低表达或者不表达的肿瘤仍然具有很强的TMZ抵抗性,这提示我们除了MGMT酶这种耐药机制外,仍然存在其他的耐TMZ机制。细胞质动力蛋白2重链1(Dynein-cytoplasmic 2-heavy chain 1, DYNC2H1,或被成为DHC2),主要参与有丝分裂时染色体的分离过程,胚胎时期神经元的分化以及细胞内小泡和各种膜结合细胞器的微管逆向运输。在前期研究中我们发现TMZ可以将U87细胞系的细胞周期阻滞在G2/M期,诱导大量细胞死亡。但在TMZ刺激下仍然存在少量存活细胞,并且它们对TMZ的敏感性开始下降,细胞形态也出现一些显著性细胞形态改变可重复改变,如大核大胞体,细长凸起以及细胞骨架的重排。我们认为细胞骨架的重排可能是导致GBM细胞对TMZ敏感性下降的原因,这种细胞骨架的重排同时伴随着一些与细胞骨架结构和功能密切相关的蛋白表达的上调,其中DHC2引起了我们的重视。DHC2的表达可以被TMZ刺激所诱导,并且这种诱导在TMZ刺激U87细胞后早期(1周)即开始出现。当细胞中DHC2表达量被TMZ刺激上调的同时,细胞出现上述细胞形态改变以及细胞骨架的重排。通过干扰DHC2蛋白的表达或使用细胞松弛素D(Cytochalasin D, CCD)联合TMZ破坏细胞骨架的重排确实能增加GBM细胞对TMZ的敏感性。这些研究结果提示我们可以通过使用以靶向DHC2通路上重要分子的TMZ增敏剂与TMZ联合使用来增加GBM细胞对TMZ的敏感性,增强GBM疗效。但是,TMZ是怎样通过上调细胞骨架相关蛋白DHC2的表达来增加GBM细胞对TMZ耐药的的具体分子生物学机制尚不是十分清楚。真核生物基因转录调控的基本环节包括了染色质结构的重塑、转录起始的调控、转录延伸的调控、转录终止的调控、转录后加工的调控以及mRNA水平的调控和细胞质定位的调控,每一个环节都受到了严密地控制,这种调控并不是由单一因素来起作用,而是由多种影响因素参与,并且相互影响,形成了一个巨大复杂但是高度有序的调控网络。在这其中,转录起始的调控是真核生物基因激活的前提,也是最重要的第一步。其本质就是DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质的相互作用。以生物素-链亲和素系统、磁珠分离技术为基础的DNA pull down技术就是在转录起始水平上研究基因表达调控,特别是启动子表达调控最合适的方式。本研究通过DNA pull down实验,利用生物素-链亲和素技术和磁珠分离技术,成功筛选出与U87细胞dync2hl启动子区域相互作用的蛋白,经过进一步质谱鉴定和生物信息学分析来确定调控DHC2表达的转录因子,并通过后续功能试验初步验证筛选转录因子对dync2hl表达调控的真实情况以及对U87细胞TMZ敏感性的影响,旨在为GBM治疗提供候选靶点。研究内容和方法1.胞核提取物以及末端带biotin标记的dync2h1启动子探针的制备持续应用200uM TMZ使用液刺激U87细胞,诱导其出现TMZ刺激后特征性细胞形态改变后,采用蛋白核质分离提取法提取并超滤置换为合适Buffer的胞核提取物。同样采用蛋白核质分离提取法提取含有0.125%DMSO的全培液培养的U87细胞,并超滤置换为合适Buffer的胞核提取物作为对照组。采用Western blot蛋白印迹实验验证核质分离效果。通过互联网相关数据库查找dync2hl启动子区域,设计5’端带生物素biotin的引物,将起始密码子ATG上游1688bp序列利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)全部扩增,作为dync2hl启动子区域探针。2.筛选dync2hl启动子区域结合蛋白采用生物素-链亲和素和磁珠筛选技术将两组胞核提取物分别与带Biotin标记的dync2hl启动子区域探针混匀后室温孵育,进行DNA pull down实验,采用不同盐离子浓度分别洗脱蛋白。收集蛋白洗脱液进行质谱兼容凝胶硝酸银银染色,找出差异条带,使用干净的刀片切下银染凝胶中肉眼观察有差异的条带,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析,获得所有差异条带蛋白的肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerpriming, PMF),利用Mascot Distiller数据库(http://www.matrixscience.com, MatrixSicence Ltd., London, UK)进行肽指纹搜索,鉴定相关蛋白。采用Uniprot数据库进行相关分子生物学功能的生物信息学分析,为下一步功能验证试验提供前期研究基础和理论依据。转录因子之间往往不是单一作用,而是多个转录因子依靠之间蛋白质相互作用形成复合物后,协同调控基因转录起始,所以我们同时采用STRING数据库进行对差异条带蛋白进行蛋白质相互作用分析。3.检验TMZ刺激下各蛋白基因表达情况采用Trizol法分别提取U87-TMZ刺激组和DMSO对照组细胞的总RNA,经反转录为cDNA后进行实时荧光定量PCR来检测所有启动子结合蛋白表达趋势的变化、自身表达量的情况以及与DHC2表达趋势变化的异同。将相关表达量明显不符合转录因子在细胞内执行激活基因转录任务的表达水平量的蛋白排除。4.干扰目标蛋白后检测dync2h1表达情况经过相关数据库进一步质谱鉴定和生物信息学分析锁定目标蛋白,通过寡核苷酸(Small interference RNA, siRNA)瞬时转染干扰目标蛋白,通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative PCR Detecting System reaction, qPCR)检测siRNA干扰效率,明确干扰效率符合下一步实验要求后,通过qPCR检测DHC2表达趋势变化。5.干扰目标蛋白后检测细胞增殖变化和对TMZ敏感性变化表达通过寡核苷酸(Small interference RNA, siRNA)瞬时转染干扰目标蛋白,通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative PCR Detecting System reaction, qPCR)检测siRNA干扰效率,明确干扰效率符合下一步实验要求后,采用CCK8细胞增殖实验检测TMZ刺激组、DMSO对照组、NC-DMSO组和NC-TMZ组,分别在基线、24h、48h、72h、4d、5d、6d等时间节点干扰后的细胞增殖变化,明确干扰目标蛋白后对U87细胞TMZ敏感性的变化结果1.成功制备胞核提取物以及末端带biotin标记的dync2h2启动子探针。使用含有200uM TMZ使用液的全培养基刺激U87细胞1周后成功诱导出细胞典型形态改变,并持续维持200uM的TMZ剂量直至2周,U87-TMZ细胞模型制备成功,设置以含有0.125% DMSO的全培养基培养的U87细胞作为对照组。将核质分离并置换buffer后的U87-TMZ组和对照组细胞胞核与胞浆提取物定量浓度,定量各组蛋白浓度分别为：TMZ组核提取液2.1ug/ul, TMZ组胞浆提取液4.8 ug/ul;对照组核提取液1.7ug/ul,对照组胞浆提取液3.2 ug/ul 。行Westernblot蛋白印迹实验验证核质分离效果,确认胞核提取液中胞浆蛋白的污染(GAPDH,146KD)以及胞浆提取液中胞核蛋白的污染(H3组蛋白,15KD)均在可以接受范围。行兼容质谱硝酸银染色,结果可见实验组和对照组胞浆和胞核提取物主要条带均明显不同,实验组与对照组之间同样也具有差异。核质分离效果适合下一步实验条件。采用酚氯仿法提取U87细胞基因组DNA作为PCR模板,行1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物发现一略大于10kb特异性条带,无拖尾降解。实验采用全基因组DNA提取方法效果良好,所提取的DNA模板可进一步用于扩增带biotin标记的dync2hl启动子序列的PCR反应。PCR扩增dync2h1启动子序列区域完毕后,行1%琼脂糖凝胶电泳确认在marker 1600bp位置有一条特异性条带,与预期一致。PCR扩增的dync2h1启动子探针适合下一步实验条件。2.成功筛选dync2h1启动子区域结合蛋白。DN A pull down实验后,分别用不同盐浓度洗脱液洗脱结合在磁珠启动子探针混合物上的蛋白,行12%SDS-PAGE凝胶电泳后,进行质谱兼容硝酸银染色。结果发现：在低盐浓度洗脱液(0.25mol/L)洗脱蛋白中,TMZ-U87组和DMSO作用的对照组之间可见13条差异条带。在高盐浓度(1mol/L)洗脱蛋白中,TMZ-U87组和DMSO作用的对照组之间可见6条差异条带。4条条带存在重合,一共存在17条差异蛋白,其中,大于180KD有2条;75KD-135KD之间有2条；63KD-75KD之间有1条；48KD-63KD之间有3条;35KD-48KD之间有3条；25KD-35KD之间有1条；17KD-25KD之间有3条；11KD-17KD之间有2条。使用事先用酒精洗干净的刀片仔细将所有具有差异的条带挖出,进行质谱分析。在获得差异蛋白的胎指纹图谱后,利用Mascot数据库查询获得蛋白信息,分析其中肽段与蛋白的匹配序列,将评分较低的蛋白排除后,一共获得11个蛋白,分别是HSPA8、PKM2、HNRNPK、ANXA2P2、ANXA2、HNRNPA2B1、 TPI1、PRDX1、PPIAL4B、PPIA、LGALS1。3.生物信息学分析锁定HNRNPK、HNRNPA2B1、PKM2可能是dync2hl表达调控蛋白。行qPCR在TMZ刺激下检测各蛋白基因以及dync2hl表达情况,结果提示：HSPA8、PRDX1、TPI1在TMZ刺激组和对照组均表达量过低(2-△Ct, X±s, PRDX1-TMZ:18.31±0.87;PRDX1-DMSO:17.95±0.71;HSPA8-TMZ:19.52±0.18; HSPA8-DMS0:28.39±0.67; TPI1-TMZ:15.17±0.37; TPI1-DMS0:14.90±0.91),不符合转录因子在细胞内执行激活基因转录任务的表达水平量,予以排除。HNRNPK在TMZ刺激下(TMZ刺激组：0.1309±0.0174,DMSO对照组：0.0626±0.0377,p=0.046)表达轻微上调;HNRNPA2B1在TMZ刺激下(TMZ刺激组：0.0372±0.0007,DMSO对照组：0.0597±0.0170,p=0.084)表达未见明显差异；PKM2在TMZ刺激下(TMZ刺激组0.0013±0.00002,DMSO对照组0.0025±0.00006,p<0.001)表达下调,差异有统计学意义。通过Uniprot数据库进行相关功能的生物信息学分析,查找具有DNA结合能力,并且既往文献报道参与基因转录调控过程的蛋白,我们将目标锁定在异质性胞核核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, HNRNPK),异质性胞核核糖核蛋白A2/B1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1,HNRNPA2B1),丙酮酸激酶同工酶M1/M2 (Pyruvate kinase isozymes M1/M2, PKM2,又称为PKM)这3种蛋白中。STRING数据库提示HNRNPK、HNRNPA2B1、 PKM2这三种蛋白之间存在明确的相互作用。4.干扰HNRNPK后,dync2h1 mRNA水平明显下降,干扰PKM2则呈现相反的趋势,而干扰HNRNPA2B1后dync2h1 mRNA水平无明显变化。行qPCR在TMZ刺激下检测各蛋白基因以及dync2h1表达情况,结果提示：干扰HNRNPK蛋白后,dync2h1表达量明显下降(2-△ct,X±s,干扰组：0.002642±0.000367,NC组：0.004644±0.000143,P<0.001),呈随着HNRNPK蛋白的下调而下调的正向调控趋势。干扰PKM2蛋白后,在统计学上两组dync2h1表达量显著上升(2-△ct,X±s,干扰组：0.004657±0.000607,NC组：0.002637±0.000414,P=0.009),存在dync2hl表达量随着PKM2蛋白的下调而上调的负向趋势。干扰HNRNPA2B1 (2-△Ct, X±s,干扰组：0.003234±0.001297,NC组：0.003342±0.001368,P>0.05),在统计学上两组间dync2hl表达量未见明显差异。因此我们推测HNRNPK 、 PKM2是在dync2h1启动子水平转录调控中起主要作用的转录因子。5.干扰HNRNPK或PKM2均可降低U87细胞增殖,并增强U87细胞对TMZ敏感性。干扰HNRNPK后检测细胞7天增殖情况,24小时以后直至第6天,干扰组细胞增殖明显缓慢于NC对照组(p值均<0.001),说明干扰HNRNPK后能降低U87细胞的增殖。同时,在干扰后24小时直至第6天,HNRNPK干扰组U87细胞在TMZ刺激下增殖明显缓慢于NC-TMZ组(p值均<0.001),说明干扰HNRNPK后U87细胞对TMZ敏感性较NC组细胞对TMZ的敏感性增强,U87细胞容易被TMZ诱导死亡。采用PKM2-siRNA 2#干扰PKM2后,从24小时以后直至第6天,干扰组细胞增殖明显较NC对照组减慢(p值均<0.001),说明干扰PKM2降低了U87细胞的增殖能力。至刺激第6天,PKM2干扰组U87细胞在TMZ刺激下存活细胞数明显少于NC-TMZ组(p值<0.001),说明干扰PKM2后U87细胞对TMZ敏感性较NC组细胞对TMZ的敏感性增强,U87细胞变得易被TMZ诱导死亡。干扰效率较PKM2-siRNA 2#相对弱的PKM2-siRNA 1#干扰U87细胞后,出现与PKM2-siRNA 2#类似的作用,干扰组细胞增殖较NC组稍减缓,但减缓程度稍轻(从24小时开始至第5天,p值均<0.001),在TMZ刺激后至刺激的第5天,干扰组存活细胞数与NC-TMZ组相比具有明显差异(p值均<0.001,刺激第6天差异无统计学意义,p值>0.05)。结论我们利用DNA pull down和质谱技术,将可能参与dync2hl表达调控的启动子结合蛋白识别鉴定出来,通过相关数据库进行生物信息学分析,将目标蛋白锁定在HNRNPK、HNRNPA2B1、PKM2这3种蛋白中。进一步进行细胞功能验证发现,dync2hl的表达均能通过干扰HNRNPK、PKM2获得表达的改变。干扰HNRNPK蛋白的表达后,U87细胞dync2hl表达随之明显下降,U87细胞的增殖也明显下降,同时U87细胞对TMZ的敏感性增强,使得细胞不易对TMZ产生抵抗。干扰PKM2后,dync2h1表达明显上调,但U87细胞的增殖能力降低,同时对TMZ的敏感性也增强,不符合dync2h1介导的U87细胞对TMZ耐药的机制中,PKM2负向调控dync2h1启动子转录表达的过程,但可能还有别的影响因素或调控机制的存在,具体方式和机制需要进一步研究。干扰HNRNPA2B1后,dync2h1表达未见明显改变,HNRNPA2B1同样可能并不参与dync2h1启动子的表达调控。结合生物信息学分析和以上实验结果,我们认为参与介导U87细胞对TMZ抵抗的dync2h1蛋白启动子水平表达调控过程的主要转录因子可能是HNRNPK。在TMZ的持续刺激下,U87细胞中HNRNPK通过上调其表达,导致其与dync2hl启动子结合增多,促进了DHC2表达,从而诱导U87细胞典型形态学改变、细胞骨架重排以及对TMZ抵抗等一系列细胞学功能变化。