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目的研究三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)的神经毒性机制,观察TOCP对calpain和蛋白酶体活性的影响,研究细胞内钙紊乱与钙信号转导对TOCP诱导SH-SY5Y细胞产生自噬的作用机制,以及探讨磷酸化和泛素化蛋白的降解机制。方法1.以RA诱导SH-SY5Y细胞分化,TOCP(0、0.25、0.5、1.0mM)染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞12h、24h和48h,以DMSO为对照组,采用20μM verapamil、100μM2-APB、20μM verapamil合并100μM2-APB分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞15min再染毒1.0mM TOCP48h,荧光分光光度计测calpain活性变化,并用Western Blot测钙通道抑制后LC3-II/I蛋白表达。2.500nM Calpastatin peptide ac184-210和自噬抑制剂3-MA(1.0mM)分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞6h和4h后染毒1.0mM TOCP48h,DMSO为对照组,收集细胞,Western Blot测LC3II/I和Beclin1蛋白的表达。3.不同浓度TOCP染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞48h,Western Blot测MAP2、p62和Ub蛋白的表达。4.培养未分化的SH-SY5Y细胞,用TOCP(0、0.25、0.5、1.0mM)进行染毒,染毒时间分别为6h、12h、24h、48h和72h,荧光分光光度计测定20S和26S蛋白酶体活性变化。结果1. calpain活性变化:随着TOCP染毒浓度和染毒时间增加,已分化与未分化的SH-SY5Y细胞内calpain活性升高(P<0.05);用verapamil、2-APB及verapamil合并2-APB预处理细胞后染毒TOCP发现,TOCP诱导的calpain活性均一定程度地受到抑制(P<0.05)。2.自噬蛋白表达:未分化与分化的SH-SY5Y细胞结果显示,与对照组比较,1.0mM TOCP染毒组LC3-Ⅱ的表达均显著增高(P<0.05);与1.0mM TOCP染毒组比较,verapamil预处理组抑制TOCP诱导的LC3-Ⅱ表达(P<0.05),verapamil合并2-APB组部分抑制LC3-Ⅱ的表达(P<0.05),2-APB增高LC3-Ⅱ表达(未分化组:P>0.05,分化组:P<0.05);在未分化的SH-SY5Y细胞,calpastatin能抑制TOCP诱导的LC3-Ⅱ表达,与对照组无差异(P>0.05),部分抑制Beclin1表达(P<0.05);在分化的SHSY5Y细胞,calpastatin部分抑制LC3-Ⅱ和Beclin1的表达(P<0.05);未分化与分化的细胞中,3-MA+TOCP组LC3-Ⅱ和Beclin1均发生明显的抑制作用(P<0.05)。3. p62、MAP-2和泛素化蛋白表达:未分化与分化的SH-SY5Y细胞中,随着TOCP浓度增高,MAP-2和p62表达降低(P<0.05),泛素化蛋白表达均增高,尤其是高分子量的蛋白泛素化表达更明显。4.蛋白酶体活性变化:不同浓度的TOCP染毒未分化的SH-SY5Y细胞不同时间,与对照组比较,20S proteasome CT-L、T-L、PGPH和26S proteasomeCT-L、PGPH活性在不同染毒浓度和时间出现不同程度的升高,26S proteasomeT-L活性随着染毒浓度的增加和染毒时间的延长呈降低趋势,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论1. TOCP能诱导已分化与未分化的SH-SY5Y细胞calpain活性,T/L-型钙离子通道和内质网上的IP3R参与细胞内钙信号转导。2. T/L-型钙离子通道造成细胞内calpain活性改变是TOCP诱导自噬的重要原因。3. TOCP能造成已分化与未分化的SH-SY5Y细胞泛素化积聚,抑制p62的表达,泛素化蛋白可能通过p62介导进入自噬溶酶体途径降解。