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自2011年底以来，全国范围内多个猪场暴发了由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的猪伪狂犬病（Pseudorabies; PR），大部分猪场在免疫过PRV gE基因缺失疫苗，且群体免疫抗体水平较高的情况下仍可发病，严重危害了我国养猪业的发展。本研究对河南省2012年以来不同地区发生PR猪场的14株PRV gE、TK基因分子变异规律进行分析；对2012年新乡市某发病猪场采集的临床病料进行了PRV分离鉴定；对分离株的gB、gE基因进行原核表达和活性检测。以期了解河南省PRV流行毒株的分子变异情况和为后续防控 PRV的疫苗研制及检测方法的建立奠定基础。 方法：1、本研究从河南省多地规模化猪场采集疑似 PRV感染病料，并参考GeneBank上发表的 TK、gE基因序列设计扩增 TK、gE基因全长的引物，对不同来源地的14株 PRV分别进行 TK、gE基因进行 PCR扩增和克隆测序，通过DNAstar和MEGA6.0等软件进行同源性分析和遗传进化分析。2、选取新乡市某疑似 PR发病猪场病猪的脑、肺脏、淋巴结等组织样品混合研磨，无菌处理后，经 PCR鉴定仅含有 PRV野毒株，取400μL上清接种于长势良好且铺满单层的PK-15细胞上，置于37℃ CO2培养箱中培养至80％左右的细胞发生病变时，反复冻融三次离心取上清进行传代接种，以此方法进行病毒的多代培养，每培养一代均留取少量用于 PRV的鉴定；分别采用 PCR方法、IFA试验、接种 BHK-21细胞和VERO细胞实验、攻毒小鼠实验等方法鉴定所分离PRV；采用噬斑纯化方法对PRV进行纯化；采用Reed-Muench法计算培养8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h后病毒的TCID50，并绘制病毒生长曲线；将灭活后的PRV免疫小鼠，共免疫4次，最后一次免疫后3天采集小鼠血并分离血清，采用IDEXX gB、gE试剂盒测定小鼠抗体效价。3、根据GeneBank上发表的gB、gE基因序列，结合文献报道，设计两条特异性引物分别扩增 gB、gE基因部分保守片段，将其克隆至pGEM-T easy克隆载体上，并亚克隆至表达载体pQE-30上，转化至大肠杆菌JM109中诱导表达，对表达的蛋白进行纯化；将纯化的重组gB、gE蛋白（rPRV-gB、rPRV-gE)转印到NC膜上，同时作为抗原包被ELISA反应板上，采用已知的PRV阳性血清和阴性血清检测重组蛋白的活性和特异性。 结果：1、14株河南分离株的gE基因氨基酸同源性为95.7%-99.8%，与2012年之前国内分离的毒株同源性较低（96.6%-98.9%），与2012年之后中国流行的毒株的同源性较高（除XX1外，同源性为98.7%-100%）；14株的TK基因氨基酸同源性为97.8%-100%，与疫苗株Bartha-K61株同源性为98.7%-99.6%，与2012年之后流行株氨基酸同源性为98.1%-100%。进化树分析显示：河南PRV流行毒株gE基因和TK基因均可分3个群，与国内2012年之后分离的大多数毒株同处于基因1群；14个分离株与国内2012年之后分离的zj-01株、TJ株亲缘关系较近，与国内经典毒株 Ea株、Min-A株、LA株次之，与国外 Becker株、Kaplan株和P-Prv株亲缘关系较远。14株PRV的TK基因较为保守，而gE基因存在很多的点突变（在第24-25、473位氨基酸位点各插入一个天冬氨酸可作为变异株的标志）。2、新乡猪场的病料中PCR检测结果仅PRV野毒阳性，而猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等均为阴性；将病料接种细胞后细胞均可发生病变，并可连续稳定传代；每一代次PRV细胞培养物 PCR鉴定结果均仅 PRV为阳性；IFA实验有明显荧光；接种BHK-21细胞、Vero细胞也均出现明显细胞病变；攻毒均出现典型病变；经过六轮噬斑纯化得到高纯度的PRV；据病毒生长曲线显示病毒接种细胞后24 h病毒含量达到峰值，TCID50为10-6.71/0.1 mL；灭活病毒免疫小鼠后，经检测效价均能达到1:10万以上，表明所分离的PRV新发毒株具有良好的免疫原性。3、通过PCR扩增可得 gB基因条带大小为621bp，gE基因条带大小为633bp，与预期扩增片段大小一致；成功构建了表达载体 pQE30-gB、pQE30-gE；诱导表达后的蛋白经纯化获得了高纯度的 rPRV-gB、rPRV-gE蛋白；经 Werstern-blot和 ELISA实验结果表明所获得的重组蛋白rPRV-gB、rPRV-gE具有较高活性和特异性。 结论：1、目前河南省PRV流行毒株为国内新发流行变异毒株，其特征为与国内2012年之前所分离的经典毒株相比gE基因在第24-25、473位氨基酸位点各插入一个天冬氨酸可作为变异株的标志，提示可能是当前疫苗保护力下降的主要原因。2、成功分离鉴定了一株新发 PRV变异株（HeNXX-2012），该毒株纯度较高可稳定传代，TCID50可达10-6.71/0.1 mL，且具有较好的免疫原性，为后期PRV新发毒株单克隆抗体的制备奠定一定基础。3、成功表达了 PRV变异株 gB、gE蛋白，该蛋白纯度较高，具有较高活性和特异性，能够与PRV阳性血清发生反应，与PRV阴性血清和CSFV、PEDV、PRRSV、FMDV阳性血清均不反应，为检测PR血清学检测方法奠定基础。