目的:①为从基因水平研究骨肉瘤的发病及发展机制、多药耐药性、基因诊断和治疗等方面提供实验平台②制备适于文库构建的DNA片段,制备EMBL4载体(λ噬菌体DNA),以阶段性构建骨肉瘤基因组DNA文库,为后期骨肉瘤基因组DNA文库的完全构建创造前提基础。研究方法:①采用酚提法从骨肉瘤组织提取高分子量DNA:以含EDTA、SDS及无DNA的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞,经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚及氯仿进行抽提,重复提取DNA并将之沉淀;②选择Sau3AI作为切割DNA的限制性核酸内切酶,根据少量酶切的结果确定最适酶切条件,然后大量不完全酶切;③用普通琼脂糖法回收目的DNA片段:先用0.5%的琼脂糖凝胶电泳,于目的片段富集处切胶,然后用酚、氯仿抽提,乙酸氨、无水乙醇沉淀;电泳分析回收的质量;④EMBL4载体的制备:以BamH I和EcoR I双酶切,以减低非重组背景。酶切后去除寡核苷酸;去磷酸化处理。结果:①采用酚提法从骨肉瘤组织提取的DNA分子量>80kb,能满足文库构建“所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍”的要求,紫外线分光度计分析A260 A280=1.83,DNA的纯度高;②在37℃,Sau3AI与骨肉瘤基因组DNA按浓度0.0033u/μg进行酶切,反应时间30min,所得目的DNA片段平均长度约20kb;③经处理后的载体纯度高,去磷酸化好。结论:①以酚提法从骨肉瘤组织提取的DNA分子量大,纯度高,能满足文库够建的要求;②用Sau3AI酶切后的目的片段大小适中,是与λ噬菌体DNA载体连接的理想片段;③经BamH I和EcoR I双酶切和去磷酸化处理后的EMBL4载体大大降低了非重组背景,为后续骨肉瘤基因组DNA文库的构建创造了良好的条件。