研究背景股骨头坏死是由于股骨头发生缺血/缺氧而引起以骨坏死为特征的一类骨科难治性疾病。在正常的骨代谢过程中,骨髓干细胞会向不同方向分化,分化成成骨细胞有利于骨生成,而分化成破骨细胞则有利于骨吸收,骨生成和骨吸收相辅相成共同组成正常的骨代谢。在股骨头坏死发生时,由于组织内部缺血/缺氧,可能会对骨髓干细胞分化及正常的骨代谢过程造成干扰。另一方面,股骨头坏死中缺血/缺氧这一病理性过程则可能诱导细胞发生内质网应激。但是,目前有关内质网应激、骨髓干细胞分化与股骨头坏死之间的关系研究的并不十分清楚。关节机械加载是以生理性频率、温和加载力的方式施加于滑膜关节(如:肘、膝和踝关节)的一类无创性物理康复治疗方法。前期研究证明:机械加载治疗可以通过促进骨形成加速股骨颈和胫骨骨损伤的修复过程。Salubrinal是一种人工合成的eIF2a的脱磷酸化抑制剂,能够缓解内质网应激起到保护细胞的作用。前期研究表明:salubrinal可以通过降低炎症反应、抑制骨量丢失等途径应用于骨关节炎和骨质疏松的治疗。尽管机械加载和salubrinal是治疗骨科疾病的有效手段,但是有关机械加载和salubrinal治疗股骨头坏死的研究尚未见报道。研究目的为深入了解股骨头坏死与骨髓干细胞分化及与内质网应激的关系并探索治疗股骨头坏死的新疗法,本研究采用了手术创伤诱导的缺血性股骨头坏死动物模型。探讨如下问题:机械加载和salubrinal是否能通过改变骨髓干细胞的分化及内质网应激过程从而调节骨重建和血管重建治疗股骨头坏死。另外,在观察疗效的基础上,我们还将salubrinal作为一种研究工具,探讨细胞内质网应激过程在股骨头坏死发生发展中起到的作用。研究方法实验一:18只SD大鼠被随机分成三组:假手术对照组(Sham,n=6)、股骨头坏死模型组(ON,n=6)和机械加载治疗组(ON+loading,n=6)。通过手术的方法切断股骨头圆韧带并结扎股骨颈造成股骨头缺血性坏死模型,双侧股骨头同时造模。治疗方案为双侧膝关节进行机械加载治疗,加载力5 N,频率15 Hz每天每侧膝关节加载5 min,治疗共持续5周。随后采用骨密度仪对动物股骨骨矿密度和骨矿含量(BMD和BMC)等指标进行检测;采用墨汁灌注的方法对股骨头内部血管重建情况进行检测;同时留取股骨头标本进行组织学分析,免疫组化分析VEGF的表达;取骨髓干细胞进行培养和诱导,对骨髓细胞分化为成骨、破骨细胞等能力进行检测。实验二:60只SD大鼠被随机分成四组:假手术对照组(Sham,n=18)、股骨头坏死模型组(ON,n=18)、salubrinal治疗组(ON+S,n=18)和给予salubrinal的假手术对照组(Sham+S,n=6)。股骨头坏死造模方法同实验一。采用μ-CT和骨密度仪对大鼠股骨头的结构参数(如:BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp)和骨密度进行检测;采用墨汁灌注的方法对股骨头内部血管重建情况进行检测;同时留取股骨头标本进行组织学分析;取骨髓干细胞进行诱导,对成骨、破骨细胞等细胞分化能力进行检测。采用免疫荧光和Western blot的方法对各组股骨头标本中p-e IF2α、ATF4、GRP78、CHOP、VEGF和NFATc1等蛋白水平进行了检测。体外实验方面,在人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中,采用细胞增殖、迁移、血管形成和Western blot等方法研究了salubrinal通过对抗内质网应激保护血管内皮细胞的作用;同时利用成骨细胞系MC3T3-E1,通过检测细胞增殖能力、成骨细胞标志蛋白(ALP和RUNX2)以及内质网应激通路相关蛋白(p-eIF2α和ATF4)的表达,研究了salubrinal通过对抗内质网应激保护成骨细胞的作用。研究结果影像学实验结果表明:股骨头坏死模型组动物股骨头内部骨量丢失严重,BV/TV、Tb.N、Tb.Th、B.Ar/T.Ar、BMD/BMC均明显降低,但是Tb.Sp明显升高;然而机械加载和salubrinal治疗均可不同程度的改善上述指标。墨汁灌注实验显示模型组动物股骨头内部血管灌注明显受损,而机械加载和salubrinal治疗均可改善血管灌注情况。骨髓干细胞诱导实验表明:模型组动物破骨细胞异常活跃,破骨细胞形成、迁移、粘附和凹陷形成能力均明显增强,而机械加载和salubrinal治疗可使异常活跃的破骨细胞趋向于恢复正常。同时机械加载和salubrinal治疗还可以促进成骨细胞和成纤维细胞的分化从而改善骨坏死。另外salubrinal通过改变股骨头组织中相关因子的表达(如:上调p-eIF2α、ATF4、GRP78、VEGF以及下调NFATc1),对股骨头坏死起到治疗作用。在体外实验中,salubrinal通过上调相关信号通路因子(如:p-e IF2α、ATF4、GRP78、ALP和RUNX2)的表达缓解内质网应激,对成骨细胞和血管内皮起到保护作用。结论本研究通过使用大鼠缺血性股骨头坏死的动物模型,证明了:1)股骨头坏死发生后可引起骨坏死、骨量丢失、血管灌注减少和破骨细胞异常活跃等表现,而机械加载和salubrinal治疗可不同程度的改善上述症状。2)机械加载和salubrinal治疗机制可能是通过调节骨髓干细胞分化途径实现的,如:抑制异常活跃的破骨细胞、促进成骨和成纤维细胞分化,从而改善股骨头坏死组织内部的血管重建和骨重建等环节。3)在股骨头坏死发生发展过程中,细胞发生了一定程度的内质网应激,而salubrinal则可以通过eIF2α磷酸化缓解内质网应激改善股骨头坏死部位的血管重建和骨重建过程,从而发挥它的治疗作用。4)随着研究的不断深入,机械加载和salubrinal有希望成为临床上治疗股骨头坏死的新方法。