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研究背景/目的:宫颈癌是世界范围内第三大常见的女性癌症,占全球女性癌症死亡人数的近7.5%。据报道,全世界每年约有52万妇女为新发的宫颈癌患者,其中约有26万患者死于该病。2015年我国就有98900例新发宫颈癌病例和30500例死亡病例。宫颈癌的治疗以手术和放疗为主,化疗为辅。早期宫颈癌患者首选手术治疗,术后辅以放疗和/或以铂类药物为基础的化疗等规范化综合治疗。淋巴转移和远处转移是宫颈腺癌患者不良预后的原因之一。已有数据结果表明,宫颈癌早期患者经治疗后其5年生存率可达90%,而在局部晚期或远处转移的患者中,特别是Ⅳ期患者,其5年生存率仅约20%。尽管以顺铂（cis-platinum,CDDP）为基础的同步放化疗可改善局部晚期患者的总生存率和无进展生存期,但约50%的晚期患者在初始治疗后的2年内出现复发。此外,由于肿瘤细胞耐药的出现和发展使得以CDDP为基础的化疗方式对晚期或者转移性宫颈肿瘤的疗效并不能令人满意,往往造成宫颈癌患者预后不佳。因此,寻找新的宫颈癌转移标记分子和有效靶标,并揭示宫颈癌耐药的相关分子机制,以早日建立新的有效的宫颈癌的治疗措施是急待解决的临床课题。长链非编码RNA UCA1（long non-coding RNA UCA1,Lnc RNA UCA1）在包含宫颈癌在内的多种肿瘤转移、侵袭和耐药性方面发挥着重要作用,但是UCA1分子机制以及UCA1是否可通过靶向mi R-143调控宫颈癌的进展及对顺铂耐药性的相关调控机制仍未被全部阐明。在本研究中,我们主要探究了UCA1是否可通过靶向抑制mi R-143的表达进而促进宫颈癌增殖、转移及侵袭,同时增强细胞对CDDP的耐药性的问题。UCA1在宫颈癌进展中的重要作用或许可成为宫颈癌治疗的有效靶标,为寻找克服宫颈癌化疗耐药问题的新方法提供理论和实验参考。研究方法:1.应用q RT-PCR技术检测UCA1在宫颈癌组织以及人宫颈上皮细胞H8和宫颈癌细胞系Hela和Si Ha中的表达水平。2.He La和Si Ha细胞中应用慢病毒载体感染技术及转染技术上调或下调UCA1和mi R-143的表达。3.利用CCK-8技术、克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室技术及流式细胞术（PI染色）、蛋白免疫印迹技术（western blotting,WB）分别用来研究UCA1和mi R-143对Hela、Si Ha细胞增殖活性、克隆形成能力、迁移、侵袭、凋亡等肿瘤生物学行为的影响。分析UCA1/mi R-143轴对Hela、si Ha细胞肿瘤生物学行为,以及对EMT过程的影响。4.双荧光素酶报告实验佐证宫颈癌细胞中UCA1和mi R-143之间相互作用关系。5.构建小鼠体内荷瘤模型分析UCA1/mi R-143轴对宫颈癌细胞成瘤能力及腹腔转移能力的影响。6.CCK-8技术、划痕实验、流式细胞术及体内荷瘤实验分别用来评估CDDP处理和/或UCA1、mi R-143、UCA1/mi R-143对宫颈癌细胞增殖活性、凋亡、转移及细胞成瘤的影响,用来评估UCA1/mi R-143在CDDP介导的抗肿瘤中的作用。结果:1.Lnc RNA UCA1对宫颈癌细胞活性的影响的研究结果1.1 45例宫颈癌组织中UCA1的表达水平显著高于癌旁正常组织,p（27）0.001。宫颈癌细胞系Hela和Si Ha中的UCA1表达水平也显著高于人宫颈上皮细胞H8中的表达水平,p（27）0.01和p（27）0.001。1.2宫颈癌Hela和Si Ha细胞系感染OE-UCA1（过表达UCA1）后,细胞中UCA1的表达明显高于感染OE-NC（OE-UCA1阴性对照组）的细胞,p（27）0.001和p（27）0.01;而感染sh-UCA1（抑制UCA1表达组）的细胞中UCA1的表达水平显著低于感染sh-NC（sh-UCA1阴性对照组）细胞,P（27）0.05。1.3过表达UCA1的He La和Si Ha细胞的增殖活性显著高于对照细胞组,P（27）0.05和P（27）0.01,抑制UCA1表达的细胞增殖活性显著低于对照细胞组,P（27）0.05。此研究结果表明,UCA1过表达可提高宫颈癌细胞活性。1.4过表达UCA1的He La和Si Ha细胞的克隆形成能力显著高于对照细胞组,P（27）0.05,抑制UCA1表达的细胞克隆形成能力显著低于对照细胞组,P（27）0.05。UCA1过表达可促进宫颈癌细胞克隆生成活性。1.5过表达UCA1的He La和Si Ha细胞的细胞迁移距离显著长于对照细胞组,P（27）0.05;抑制UCA1表达的细胞迁移距离显著短于对照细胞组,P（27）0.05。UCA1过表达可增强宫颈癌细胞的迁移能力。1.6 Transwell小室检测发现,过表达UCA1的He La和Si Ha细胞的侵袭能力较对照细胞组显著增强,P（27）0.05,抑制UCA1表达的细胞侵袭能力较对照细胞组显著降低,P（27）0.05。UCA1过表达可增强宫颈癌细胞的侵袭能力。1.7流式细胞检测显示,过表达UCA1的He La和Si Ha细胞的凋亡水平显著低于对照细胞组,P（27）0.05,抑制UCA1表达的细胞凋亡水平显著高于对照细胞组,P（27）0.05。UCA1过表达可抑制宫颈癌细胞凋亡。2.mi R-143对宫颈癌细胞的作用的研究结果2.1双荧光素酶报告实验结果显示,与mimics-NC组细胞相比,上调mi R-143表达后可明显降低Luc-UCA1-WT（Luc-UCA1野生型）的荧光素酶活性,（P（27）0.05）。但对Luc-UCA1-MUT（Luc-UCA1突变型）的荧光素酶活性没有明显影响。2.2体外功能缺失（loss-of-function）实验显示,与转染inhibitor-NC（mi R-143-inhibitor阴性对照组）细胞相比,抑制mi R-143表达（mi R-143-inhibitor）的He La和Si Ha细胞mi R-143的表达水平受到明显抑制,P（27）0.05。2.3与转染inhibitor-NC细胞相比,在He La和Si Ha细胞抑制mi R-143表达可显著提高肿瘤细胞的增殖活性,P（27）0.05。2.4与转染inhibitor-NC细胞相比,抑制mi R-143表达可明显增强He La和Si Ha细胞的迁移能力,P（27）0.05。2.5与转染inhibitor-NC细胞相比,抑制mi R-143表达可明显增强He La和Si Ha细胞的侵袭能力,P（27）0.05。2.6抑制mi R-143表达可使He La和Si Ha细胞的凋亡水平降低,P（27）0.05。3.Lnc RNA UCA1靶向抑制micro RNA-143调控宫颈癌的发展的研究结果3.1与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1（过表达UCA1）+mimics-NC（mi R-143-mimics阴性对照组）的He La和Si Ha细胞中mi R-143的表达均明显降低,P（27）0.05;OE-UCA1+mi R-143-mimics（过表达mi R-143）组的He La和Si Ha细胞较OE-UCA1+mimics-NC组mi R-143表达水平显著增高,P（27）0.05。表明过表达mi R-143可明显逆转过表达UCA1对mi R-143的抑制作用。3.2与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞活性均明显增强,P（27）0.05;OE-UCA1+mi R-143-mimics组较OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞活性均明显降低,P（27）0.05。UCA1通过靶向mi R-143增强了宫颈癌细胞活性。3.3与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞迁移能力均明显增强,P（27）0.05;OE-UCA1+mi R-143-mimics组较OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞迁移能力均明显降低,P（27）0.05。表明UCA1通过靶向mi R-143增强了宫颈癌细胞迁移能力。3.4与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞侵袭能力均明显增强,P（27）0.05;OE-UCA1+mi R-143-mimics组较OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞侵袭能力均明显降低,P（27）0.05。表明UCA1通过靶向mi R-143增强了宫颈癌细胞侵袭力。3.5与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞发生凋亡的比率均明显降低,P（27）0.05;OE-UCA1+mi R-143-mimics组较OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞发生凋亡的比率均显著增高,P（27）0.05。表明UCA1通过mi R-143抑制宫颈癌细胞凋亡。3.6与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimics-NC组的He La和Si Ha细胞中E-cadherin蛋白的表达明显降低,而ICAM1和Vimentin蛋白的表达水平明显升高,P（27）0.05,而在同时过表达mi R-143时明显抑制了该作用。表明UCA1通过靶向mi R-143诱导宫颈癌细胞EMT。3.7荷瘤实验结果显示,与OE-NC组的宫颈癌细胞相比,OE-UCA1+mimic-NC组的He La和Si Ha细胞小鼠荷瘤体积和质量均明显提高,P（27）0.05;而在同时过表达mi R-143时He La和Si Ha细胞小鼠荷瘤体积和质量均明显明显减小,P（27）0.05;表明UCA1通过靶向mi R-143诱导宫颈癌细胞成瘤。3.8腹腔注射实验结果显示,过表达UCA1的He La细胞增加了腹部转移结节的数量,而同时过表达mi R-143可以减少腹腔转移结节的数目,且差异具有统计学意义（P（27）0.05）。表明UCA1通过靶向mi R-143增强宫颈癌细胞的腹腔转移能力。4.Lnc RNA UCA1靶向抑制micro RNA-143增强宫颈癌对顺铂的耐药性的研究结果4.1 CDDP处理的He La和Si Ha细胞中UCA1表达显著高于未处理细胞,P（27）0.05。4.2 OE-NC组和OE-UCA1组He La细胞对CDDP的IC50值分别为3.52μM和7.398μM,Si Ha细胞为4.265μM和10.48μM。与OE-NC组相比,OE-UCA1组可明显提高宫颈癌细胞的IC50。4.3与OE-NC组相比,CDDP处理后He La和Si Ha细胞的活性受到明显抑制。过表达UCA1的细胞经CDDP处理后细胞活性较对照组经CDDP处理的细胞显著提高,P（27）0.05。4.4与OE-NC组相比,CDDP处理后He La和Si Ha细胞的迁移能力受到明显抑制,P（27）0.05;而UCA1过表达后CDDP的该作用受到明显抑制。4.5 CDDP处理后较OE-NC组He La和Si Ha细胞凋亡水平明显升高,P（27）0.05;而UCA1过表达细胞,CDDP诱导凋亡的作用受到明显抑制,P（27）0.05。4.6与对照组相比,抑制mi R-143表达可明显提高宫颈癌细胞的IC50,而mi R-143过表达可明显降低宫颈癌细胞对CDDP的IC50。4.7与inhibitor-NC组相比,mi R-143过表达组以及CDDP处理后He La和Si Ha细胞的活性受到明显抑制,P（27）0.05,抑制mi R-143后CDDP抑制细胞活性的作用受到限制,而过表达mi R-143组较对照组细胞活性明显降低。4.8较inhibitor-NC组相比,CDDP处理后He La和Si Ha细胞凋亡比例明显增加,P（27）0.05;抑制mi R-143表达后CDDP诱导凋亡的作用受到明显抑制,而过表达mi R-143后CDDP诱导凋亡的作用得到增强。4.9与OE-NC组相比,OE-UCA1组He La和Si Ha细胞对CDDP的IC50值明显增加,而同时过表达mi R-143后该作用受到明显抑制。4.10与对照组比较,OE-UCA1组He La和Si Ha细胞经CDDP处理后活性明显增加,P（27）0.05;而同时过表达mi R-143的细胞经CDDP处理后细胞活性显著低于OE-UCA1组。4.11与对照组相比,OE-UCA1组He La和Si Ha细胞经CDDP处理后凋亡细胞明显减少,P（27）0.05;而同时过表达mi R-143的细胞经CDDP处理后凋亡细胞数明显增加,P（27）0.05。4.12体内小鼠荷瘤实验显示,较对照组相比,同样进行CDDP治疗后UCA1过表达组的He La和Si Ha细胞的体内成瘤能力明显提高,而该作用在mi R-143上调后受到显著抑制。结论:1、本实验研究表明UCA1具有增强宫颈癌细胞的增殖、转移和侵袭的生物学功效,促进了宫颈癌的发生与进展;而mi R-143则抑制这一肿瘤发生过程具有抑癌功效。2、研究结果揭示UCA1可能是通过靶向抑制micro RNA-143调控宫颈癌的发展;UCA1/mi R-143的靶标分子平衡,或许能在宫颈癌进展的诊治过程中承载潜在的应用价值。3、实验结果还显示UCA1可通过靶向抑制mi R-143的表达,进而增强宫颈癌细胞的顺铂抗性,提示UCA1/mi R-143轴或许可成为攻克宫颈癌耐药性的有效靶点。