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肠道微生物与宿主之间存在着广泛的非致病关系,肠道共生微生物影响着宿主的生长发育、能量代谢、有害物质降解、免疫防御系统成熟等。如大部分后生动物一样,昆虫肠道上皮细胞无时无刻不与微生物接触,其种类从有益的共生菌、非共生菌、随食物进入的微生物到影响宿主生命的病原菌。在这样一种复杂的环境中,为了实现防御肠道病原微生物的同时又能维持共生微生物稳定的目的,宿主肠道上皮细胞必须在免疫应激和免疫耐受之间保持一种稳态平衡。Duox-ROS免疫系统和免疫缺陷(immune deficiency,Imd)信号通路作为肠道免疫反应的基本途径,必然参与调节此过程,然而人们对于宿主如何通过肠道免疫机制来维持其肠道微生物菌群稳态以保持其功能的分子机理尚不清楚。本研究以橘小实蝇为研究对象,利用RNAi、qRT-PCR和Illumina MiSeq细菌16S rDNA高通量测序等分子生物学手段研究BdDuox基因在宿主肠道免疫及肠道细菌群落稳态平衡调控中的重要作用;ROS对宿主生理功能的影响;阐述Imd信号通路在宿主免疫防御中的作用。1 Duox-ROS系统在肠道免疫和细菌群落稳态调控中的作用通过克隆获取橘小实蝇双氧化酶(dual oxidase,BdDuox)基因编码区核酸序列长度4584bp,该基因编码1528个氨基酸,BdDuox蛋白具有7次跨膜结构,拥有典型的过氧化物酶结构域。研究发现Duox-ROS防御系统在橘小实蝇肠道免疫防御中发挥着重要作用,橘小实蝇取食大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌6h和12h后,肠道BdDuox基因表达量和ROS水平显著上调;而取食肠道共生菌6h后,除次要菌群蜡样芽孢杆菌能够显著诱导BdDuox基因表达量和ROS水平显著上升外,其余5种肠道主要菌群均不能引起BdDuox基因的免疫响应,Duox-ROS免疫防御系统清除病原菌同时耐受肠道共生菌。注射BdDuox dsRNA后的1-7天,BdDuox基因表达量下调了26-54%,肠道ROS水平下降31-44%;注射BdDuox dsRNA后的9-17天,BdDuox基因上调了1.40-1.68倍,肠道ROS水平增加45-73%;而注射BdDuox dsRNA后的第20天,ds-duox干扰组BdDuox基因表达量和肠道ROS水平恢复到和ds-egfp对照组相一致水平。注射BdDuox dsRNA后的第5天和15天,橘小实蝇肠道细菌菌群密度分别增加了1.68和1.49倍,其中肠道主要菌群Enterobacteriaceae和Leuconostocaceae相对比例显著下降,Bacillaceae、Bacteroidaceae、Verrucomicrobiaceae等次要菌群相对比例显著增加,致使肠道细菌群落稳态紊乱;紊乱的肠道细菌群落反过来刺激宿主肠道上调表达BdDuox基因水平,介导大量ROS的产生来抑制次要菌群的过量增殖,最终在Duox-ROS系统调控下恢复肠道细菌群落稳态平衡。以上结果表明BdDuox基因在橘小实蝇肠道细菌群落稳态调控中发挥了重要作用。2 ROS对橘小实蝇成虫生理功能的影响通过RNAi技术发现BdCatalase基因在橘小实蝇肠道氧化还原平衡维持、成虫生殖力和寿命中具有重要作用。研究结果发现注射BdCat dsRNA后的1-7天,相比于对照组,BdCat基因显著下调了54.04-75.42%,而ds-cat干扰组肠道ROS水平上升了1.37-1.62倍;注射BdCat dsRNA后的第5天和10天,ds-cat干扰组肠道总细菌菌群密度分别下降了33.91%和34.78%。通过RNAi沉默BdDuox和BdCat基因研究ROS对宿主寿命的影响实验中,结果发现BdDuox和BdCat基因的沉默均不会影响宿主的平均寿命和总存活时间,但BdCat基因的沉默会延长宿主的中位生存期(Median survival time)。另外,本研究发现BdCat基因的沉默所造成的ROS水平上升会显著降低宿主的产卵量和卵孵化率,ds-cat干扰组雌虫在BdCat基因沉默后14-20天,单头雌虫日均产卵量下降了31.01-57.09%,ds-cat干扰组卵孵化率下降了25.45%;而BdDuxo基因的沉默所导致的ROS下降却对宿主产卵量和卵孵化率无显著影响。而通过喂食橘小实蝇化学物质研究ROS对宿主寿命的影响实验中,研究结果发现橘小实蝇取食百草枯和维生素C后7天,供试虫体全部死亡,两种化学物质喂食所导致的ROS上升和下降大大降低了宿主寿命。3橘小实蝇IMD信号通路免疫防御功能研究通过对橘小实蝇进行条件致病菌注射和喂食感染,研究Imd信号通路在宿主系统和肠道免疫反应中的作用。研究结果发现大肠杆菌DH5α注射侵染后会迅速激活Imd信号通路系统免疫反应,BdDiptericin、BdRelish、BdPGRP-LB、BdPGRP-SB基因表达水平显著上调,而BdPGRP-SC2基因表达量在注射后的3-12h显著下调了55.63-90.73%。大肠杆菌DH5α短期喂食感染只能够诱导肠道Duox-ROS免疫系统的免疫响应,以及肠道Imd信号通路关键因子BdRel基因和BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的免疫响应。在大肠杆菌DH5α喂食感染后的3-12h,BdDuox基因表达量显著上调了1.70-2.89倍,却不能诱导Imd信号通路效应基因BdDpt的上调表达。在对PGRPs家族基因功能的研究中,我们发现BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因在橘小实蝇Imd信号通路中具有重要负调控作用,BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的沉默会导致Imd信号通路对大肠杆菌DH5α出现过激免疫响应。在大肠杆菌DH5α长期连续喂食感染生测实验中,我们发现大肠杆菌DH5α喂食感染的6h和12h只诱导Duox-ROS免疫系统的免疫响应,不能激活肠道Imd信号通路的免疫反应,与短期喂食感染结果相类似;而在大肠杆菌DH5α喂食感染后的第3天,能够激活肠道Imd信号通路强烈免疫响应,大肠杆菌DH5α喂食后3-15天,肠道BdDpt基因上调了10.50-26.95倍;但肠道Duxo-ROS免疫系统在3-15天处于静默状态,这些结果说明肠道Imd信号通路与Duox-ROS两条信号的免疫响应存在时序差异。另外,大肠杆菌DH5α的长期喂食能够诱导脂肪体中BdDpt基因的上调表达,大肠杆菌DH5α喂食后的5-15天,脂肪体中的BdDpt基因同样出现上调了4.08-7.25倍,且H2O2和百草枯的喂食所导致的肠道内ROS水平的增加能够提前诱导肠道IMD信号通路对大肠杆菌DH5α的免疫响应,表明ROS在肠道Duox-ROS免疫防御系统和Imd免疫信号通路免疫互作中发挥了重要作用。