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微囊藻毒素(microcystin,MCs)是一类毒性强的环七肽毒素,其会对养殖水环境造成严重危害。Keap1-Nrf2信号通路是保护细胞免受各种环境毒物的损伤的主要途径,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)是Cul3依赖性泛素连接酶复合物的BTB-Kelch型底物衔接蛋白,Keap1靶向促进核转录因子红细胞系相关因子-2(Nrf2)的泛素化降解。在氧化应激下,Keap1-Nrf2信号通路会调控下游Ⅱ相解毒/抗氧化酶对细胞起保护作用。本实验对褶纹冠蚌Keap1进行鉴定与功能的分析以及对Nrf2-Keap1信号通路在微囊藻毒素作用下转录调控的研究,这将有助于了解贝类的氧化应激调控机制。1.从构建的褶纹冠蚌血细胞转录组文库中筛选出两种类型的Keap1(Keap1a和Keap1b)基因片段,设计特异引物和使用RACE PCR技术成功的克隆出了CpKeap1a和CpKeap1b基因的cDNA序列全长。CpKeap1a基因cDNA序列全长2952 bp,其中5’非编码区有351 bp,3’非编码区有762 bp,开放阅读框长度为1839 bp,共编码612个氨基酸,该蛋白含一个poly(A)尾,无信号肽序列,蛋白理论分子量为68.33 KDa,等电点为6.80。CpKeap1b基因cDNA序列全长3710 bp,其中5’非编码区有87 bp,3’非编码区有1928 bp,开放阅读框1695 bp,共编码564个氨基酸,该蛋白无信号肽序列,该蛋白理论分子量为63.88 KDa,等电点为5.28。氨基酸序列分析表明,与人、小鼠、斑马鱼等都具有高度保守的BTB域,IVR域,DGR域,小鼠Keap1的IVR域中Cys-273和Cys-288的半胱氨酸残基是抑制Nrf2活性所必需的,而CpKeap1a含有对应的两个半胱氨酸残基,CpKeap1b中并不存在这两个半胱氨酸残基。2.利用实时荧光定量PCR检测了CpKeap1a、CpKeap1b基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达情况。结果表明CpKeap1a、CpKeap1b基因在血细胞、外套膜、肌肉、鳃和肝胰脏中均有表达,但表达量存在一定差异,其都在肝胰脏中的表达量最高,肌肉中次之,外套膜中表达量最低。肝胰脏是贝类中其主要的解毒器官,在肝脏中表达量最高,说明其参与肝脏的免疫作用。3.用微囊藻毒素刺激后,检测CpKeap1a、CpKeap1b基因在血细胞和肝胰脏中的表达量情况。微囊藻毒素刺激组与生理盐水组相比,2个基因在血细胞和肝胰脏中表达都呈下调趋势,CpKeap1a在血细胞中12和24 h时显著下调,在肝胰腺中48 h时显著下调。CpKeap1b在血细胞中48 h时显著下调,在肝胰腺中12和48 h时显著下调,说明CpKeap1可能参与褶纹冠蚌的免疫反应,其表达量减少,推断是减弱了对CpNrf2的锚定从而降低了对其的泛素化蛋白酶体途径降解。4.用CpNrf2-siRNA、CpKeap1a-siRNA有效的干扰CpNrf2、CpKeap1a基因后,在微囊藻毒素刺激下,与健康组相比,Nrf2依赖性下游靶基因锰超氧化物岐化酶(CpMnSOD)、铜锌超氧化物岐化酶(CpCu/ZnSOD)、硫氧还蛋白(CpTRX),过氧化物还原酶(CpPrx),硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶(CpSe-GPx),谷胱甘肽S-转移酶(Cpsigma-GST)和过氧化氢酶(CpCAT)在肝胰脏中的表达量均呈现上调趋势,而在敲低CpNrf2组中,这些基因的表达量明显低于MC组的并呈Nrf2依赖性。相反的,在敲低CpKeap1a组中,这些基因的表达量明显地高于MC组,这说明MCs可以激活Nrf2-Keap1信号通路,并且可以调控Nrf2依赖性下游的抗氧化/解毒基因消减MCs的毒素。5.截取CpKeap1a基因的C端保守区域(CpKeap1a-DC)和表达载体PET-32a经BamH1和XhoI1双酶切之后,连接并成功构建了PET-32a-CpKeap1a-DC原核表达质粒。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中进行原核表达,得到大量的融合蛋白,通过超声破碎对其上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白胶电泳检测,结果表明重组蛋白以包涵体形式存在,并测得其纯化蛋白浓度为0.314 mg/mL。