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肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）是由肝功能严重不足引起的神经功能紊乱综合征，是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一。关于其发病机制的学说众多，至今尚未完全阐明，临床上也无特效疗法。HE的运动障碍和中枢神经系统（central nervous system, CNS）内的基底神经节的精细调控状态密切相关。在基底神经节复杂的网络中，黑质网状部（substantia nigra pars reticulate, SNr）是运动调控环路上的关键一环，主要由γ-氨基丁酸（Gamma-amino butyric acid, GABA）能投射神经元组成。研究表明，GABA与HE的脑细胞功能紊乱密切相关，但其作用机制尚不明确。氯离子（Cl~-）是细胞内最重要的阴离子。特别在神经系统，神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态，即形成氯离子稳态，是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。氯离子稳态失衡可引起GABA能传递的改变，氯离子稳态及其调控因子已经成为多种GABA相关神经病理性疾病的潜在治疗靶点。研究显示CNS内不同部位的氯稳态失衡参与多种神经功能紊乱，然而其在HE中的作用尚不清楚。Na~+-K~+-2Cl~-共转运体1（Na~+-K~+-Cl~-cotransporter1, NKCC1）和K~+-Cl~-共转运体2（K~+-Cl~-cotransporter2, KCC2）是一组结构相似、功能截然相反的氯离子转运体。NKCC1为氯离子内向转运体，KCC2为氯离子外向转运体，两者共同介导神经元氯离子稳态以实现对GABA效应的调控。研究表明，NKCC1和KCC2在多种GABA相关神经病理性疾病中发生表达或者功能的改变，进而实现对GABA能神经传递的影响作用。然而，这两个转运体在HE发病机制中是否发挥作用尚不明确。本研究深入探讨HE状态下SNr内的氯离子稳态失衡情况及可能的分子机制，以期从新的角度阐明HE的中枢发病机制、为寻找有效的HE临床治疗手段提供实验室依据。本研究使用谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）67-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）转基因小鼠。在该基因敲入小鼠体内，GFP的表达受GAD67启动子序列的调控，因此所有的GABA能神经元均被GFP绿色荧光蛋白所标记，该特点能够很好的解决传统染色方法无法清晰、准确的标记GABA能神经元这一关键问题。目的：1、以GAD67-GFP转基因小鼠为研究对象，探讨SNr内GABA能神经元氯稳态失衡在急性HE运动缺陷中的作用及可能的作用机制。2、检测临床上不同类型患者的NKCC1、KCC2的表达水平，同时分析其与患者肝脏功能、神经功能之间的关系。方法：1、使用硫代乙酰胺（thioacetamide, TAA）腹腔注射建立HE模型，通过血清转氨酶检测、血氨及大脑氨含量的测定、大脑含水量测定、肝脏组织学染色、神经系统功能评分、旷场实验等来验证实验小鼠出现HE及运动迟缓；利用荧光染料孵育脑薄片结合激光共聚焦显微镜观察，检测HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度的变化情况；利用实时定量反转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测NKCC1和KCC2的表达变化情况；进行双重免疫染色法，即使用抗GFP抗体检测SNr内GABA能神经元和使用抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）抗体检测黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺神经元，检测KCC2在神经元中亚细胞分布情况；进行神经元尼氏染色评估TAA处理是否会改变SNr内GABA能神经元的数量；通过立体定位手术黑质内注射NKCC1选择性抑制剂布美他尼或KCC2阻断剂己二酸二异辛酯（di-isooctyladinpate, DIOA），评估其对血清转氨酶水平、血氨水平、大脑氨含量、大脑含水量、肝脏组织学染色、运动能力等的影响。2、利用实时定量RT-PCR检测36名患有Ⅲ-Ⅳ期HE的肝硬化患者、20名未患HE的肝硬化患者及15名健康对照组的NKCC1和KCC2的mRNA水平，使用2CT方法计算表达情况。同时分析KCC2的水平与Child-Pugh评分、MELD评分、Glasgow昏迷评分及血氨水平的相关性。结果：1、TAA处理导致HE和运动迟缓。氯离子成像结果显示HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度升高。HE小鼠KCC2在mRNA及蛋白水平的表达都下降，在神经元细胞膜处的表达下降尤为明显；与此相反，NKCC1的表达没有明显变化。TAA处理并不能改变SNr内GABA能神经元的数目。黑质内注射DIOA使正常小鼠的血清转氨酶水平升高，而黑质内注射布美他尼，虽然能改善HE小鼠的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平，但并不能降低天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平。黑质内注射DIOA的正常小鼠肝脏组织学染色结果基本正常，黑质内注射布美他尼并不能改善HE小鼠的肝脏坏死和炎性病变。黑质内注射DIOA和布美他尼的HE小鼠在血氨水平、大脑氨含量和大脑含水量等方面，没有明显变化。黑质内注射DIOA可导致运动能力的下降，在HE小鼠可导致运动迟缓进一步加剧；相反，在HE小鼠黑质内注射布美他尼并不能使其运动能力恢复正常。2、患有HE的肝硬化患者KCC2mRNA的水平与未患HE的肝硬化患者及健康对照组相比明显下降；然而，NKCC1mRNA水平在各组之间无明显差异性。此外，患有HE的肝硬化患者的KCC2mRNA水平与Child-Pugh评分、MELD评分及血氨的水平呈负相关，与Glasgow昏迷评分呈正相关。结论：1、氯稳态失衡可能是HE导致的运动迟缓的病理生理学基础，恢复氯稳态的相关药物可能成为治疗肝功能衰竭的潜在性选择。2、KCC2和NKCC1的表达失衡可能成为预测HE的信号。