论文部分内容阅读
本研究以河北省承德市平泉县不同林分油松林为研究对象,通过野外试验处理和室内分子实验分析,设置对照处理,每株10头油松毛虫(Dendrolimus tabulaeformis)取食处理,每株30头油松毛虫取食处理和剪叶处理(剪叶处理程度与30头油松毛虫取食处理相同),结合cDNA-SRAP的基因表达差异研究方法,初步研究了自然条件下不同林分油松在不同处理条件下的基因表达差异,分析产生差异的原因,以及差异表达基因的功能进行分析,为进一步确认油松在自然环境下林分类型和油松毛虫取食的共同作用下产生诱导抗性的结构机制研究提供基因层面的证据。主要研究结果如下: (1)利用正交试验设计L16(45)对PCR反应体系的TaqDNA聚合酶、模板cDNA、引物、Mg2+、dNTP这五个因素在四个水平上进行优化。使用SPSS软件对PCR结果结合方差分析和直观分析。确定了可用于油松研究的cDNA-SRAP最优的扩增反应体系(20μL):Taq酶2.0U,CDNA模板用量80~120 ng,引物浓度0.4μmol/L,Mg2+浓度1.5 mmol/L,dNTP浓度0.2 mmol/L,2μL00×Taq Buffer,用ddH2O补足。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,35℃退火50 s,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性50 s,将退火温度升为50℃退火50 s,72℃延伸0 min,35个循环;最后,72℃延伸10 min;4℃保存。 (2)利用优化后的cDNA-SRAP技术,对225对SRAP引物进行筛选,从中选取20对引物组合进行统计,共扩增的到油松基因表达差异条带256条,基因表达差异条带92条。纯林扩增出118条,其中包含差异表达片段45条;混交林扩增出138条,其中包含差异表达片段47条。10头油松毛虫取食处理共得到基因表达差异24条,30头油松毛虫取食处理共得到基因表达差异条带37条,剪叶处理共得到基因表达差异条带31条。结果显示,产生的基因表达类型主要是上调表达型和下调表达型;不同林分类型中的油松基因表达差异不明显;不同处理对油松的基因有着明显的诱导作用,并且诱导作用随着胁迫处理的强度增加而增强,增强的效果使得某些基因表达增强。机械损伤也可以诱导油松产生基因表达差异,但作用强度弱于相同强度的油松毛虫取食。 (3)对10个差异表达转录衍生片段进行了测序,根据其碱基序列在NCBI网站上进行了Blast-X的比对,其中四个片段找到了相应的同源蛋白。分别是TDF-1、TDF-2、TDF-4、TDF-8,长度分别为253 bp、221 bp、320 bp、259 bp。对应的同源蛋白分别为假定蛋白、纤维蛋白、醌氧化还原蛋白、泛素交联酶。 从研究结果可以得出初步结论,林分类型没有对油松基因表达产生诱导效应;而不同程度油松毛虫取食以及剪叶损伤均能使油松基因表达发生改变,不同处理对油松的基因有着明显的诱导作用,并且诱导作用随着胁迫处理的强度增加而增强。