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目的：人细小病毒B19(Human Parvovirus B19，以下简称B19病毒)是一种可致人类多种疾病的小DNA病毒，主要经呼吸道和血液途径传播，可引起社区局部流行。诸多研究表明B19病毒可能与一过性再障危象、传染性红斑、急性血小板减少性紫癜及非免疫性胎儿水肿等疾病相关。B19病毒在我国人群中也有较高的感染率，尤其免疫功能低下或缺陷患者可发生持续感染和慢性贫血，重者危及生命。B19病毒是由5.6kb核苷酸组成，编码一个非结构蛋白(NS)和两个结构蛋白(VP1、VP2)。近年国外研究发现B19病毒不同地区流行株之间的基因有明显变异。B19病毒NS蛋白具有细胞毒性，可诱导靶细胞凋亡，其变异与B19病毒致病力密切相关。国内对于B19 第四军医大学硕士学位论文 病毒NS基因变异研究较少。近年来分子克隆技术的发展突飞猛进， 分子克隆的方法亦多种多样，特别是PCR技术的应用，使得分于克 隆技术的应用日益广泛。PGEM－T载体可以亘接克隆PCR产物。本研 究拟对中国大陆流行株NS基因进行克隆，并进行NS基因全长核苦 酸序列分析，研究NS基因的变异性。 方法：自行设计B19病毒NS基因前后相互交叉的4对内引物及 1对全长引物，此4对内引物可分段扩增出B19病毒NS基因全长序 列，分别为NSA（569bD，＂t436－992）、NSB（582hp，＂t982刁151）、 肪C（“儿Dnn砧7－刀n）、吧D66比p，nd陀卜既d）：1对全长引物 可扩增出B19病毒NS基因全长序列（2096hp，＂t406－2501）。用4对 内引物以PCR法从从3例2001年在本院儿科确诊为再生障碍性贫血 患儿血清中扩增 NS基因进行测序，获得我国 3株 BIg病毒 NS基因 全长序列资料。再用l对全长引物（NSf、NSr）从其中1例中扩增出 NS、l对内引物（NSDf、NSD，）扩增出NSD，将其分别与pGEM－T质粒 载体连接，构建 NS－pGEM－T、NSD－pGEM－T质粒。 结果：O）与国外己发表的 BIg AU株的 NS基因序列相比，我国 B19病毒卜S基因XA17、XA18、XA20 3株共有4处核苦酸发生改变， 4处突变均导致相应编码的氨基酸发生变化。XA株第1082位碱基 由T变为C，相应的氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸：XA株第1m9 位碱基由T变为C，相应的氨基酸由频氨酸变为丙氨酸：肌0株第 52位碱基由 T变为 C，相应的氨基酸山亮氨酸变为丝氨酸；第 1552 位碱基由G 变为C，相应的氨基酸由亮氨酸变为丝氨酸。位于 ＂t2092－2451的基因区域未发现变异。（2）建立了新的PCR检测B19 DNA 的方法，经证明是一种特异、敏感的检测手段八3）构建的 ＼S－PGEM－T、NSD－PGEM－T质粒经酶切、琼脂糖电泳显示出与预期一致 2 第四军医大学硕士学位论文 的条带。 结论：（1）本文采用自行设计 BIg病毒 NS基因前后相互交叉的 4对内引物及1对全长引物，用PCR方法均能扩增出目的基因片段。 可作为PCR特异、敏感地检测B19 DNA的方法。（2）3株中国＊ 病 毒吧基因与国外AU株基因相比共有有4处变化，并且均导致相应 编码的氨基酸发生变化。（3旧19病毒中国株V基因的获得及克隆， 将有助于阐明其致病的分子机制，对 BIg病毒 DNA PCR诊断试剂及 B19病毒感染的防治、控制其社区局部流行均具有重要的意义。