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目的:人细小病毒B19(Human Parvovirus B19,以下简称B19病毒)是一种可致人类多种疾病的小DNA病毒,主要经呼吸道和血液途径传播,可引起社区局部流行。诸多研究表明B19病毒可能与一过性再障危象、传染性红斑、急性血小板减少性紫癜及非免疫性胎儿水肿等疾病相关。B19病毒在我国人群中也有较高的感染率,尤其免疫功能低下或缺陷患者可发生持续感染和慢性贫血,重者危及生命。B19病毒是由5.6kb核苷酸组成,编码一个非结构蛋白(NS)和两个结构蛋白(VP1、VP2)。近年国外研究发现B19病毒不同地区流行株之间的基因有明显变异。B19病毒NS蛋白具有细胞毒性,可诱导靶细胞凋亡,其变异与B19病毒致病力密切相关。国内对于B19 第四军医大学硕士学位论文 病毒NS基因变异研究较少。近年来分子克隆技术的发展突飞猛进, 分子克隆的方法亦多种多样,特别是PCR技术的应用,使得分于克 隆技术的应用日益广泛。PGEM-T载体可以亘接克隆PCR产物。本研 究拟对中国大陆流行株NS基因进行克隆,并进行NS基因全长核苦 酸序列分析,研究NS基因的变异性。 方法:自行设计B19病毒NS基因前后相互交叉的4对内引物及 1对全长引物,此4对内引物可分段扩增出B19病毒NS基因全长序 列,分别为NSA(569bD,"t436-992)、NSB(582hp,"t982刁151)、 肪C(“儿Dnn砧7-刀n)、吧D66比p,nd陀卜既d):1对全长引物 可扩增出B19病毒NS基因全长序列(2096hp,"t406-2501)。用4对 内引物以PCR法从从3例2001年在本院儿科确诊为再生障碍性贫血 患儿血清中扩增 NS基因进行测序,获得我国 3株 BIg病毒 NS基因 全长序列资料。再用l对全长引物(NSf、NSr)从其中1例中扩增出 NS、l对内引物(NSDf、NSD,)扩增出NSD,将其分别与pGEM-T质粒 载体连接,构建 NS-pGEM-T、NSD-pGEM-T质粒。 结果:O)与国外己发表的 BIg AU株的 NS基因序列相比,我国 B19病毒卜S基因XA17、XA18、XA20 3株共有4处核苦酸发生改变, 4处突变均导致相应编码的氨基酸发生变化。XA株第1082位碱基 由T变为C,相应的氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸:XA株第1m9 位碱基由T变为C,相应的氨基酸由频氨酸变为丙氨酸:肌0株第 52位碱基由 T变为 C,相应的氨基酸山亮氨酸变为丝氨酸;第 1552 位碱基由G 变为C,相应的氨基酸由亮氨酸变为丝氨酸。位于 "t2092-2451的基因区域未发现变异。(2)建立了新的PCR检测B19 DNA 的方法,经证明是一种特异、敏感的检测手段八3)构建的 \S-PGEM-T、NSD-PGEM-T质粒经酶切、琼脂糖电泳显示出与预期一致 2 第四军医大学硕士学位论文 的条带。 结论:(1)本文采用自行设计 BIg病毒 NS基因前后相互交叉的 4对内引物及1对全长引物,用PCR方法均能扩增出目的基因片段。 可作为PCR特异、敏感地检测B19 DNA的方法。(2)3株中国* 病 毒吧基因与国外AU株基因相比共有有4处变化,并且均导致相应 编码的氨基酸发生变化。(3旧19病毒中国株V基因的获得及克隆, 将有助于阐明其致病的分子机制,对 BIg病毒 DNA PCR诊断试剂及 B19病毒感染的防治、控制其社区局部流行均具有重要的意义。