目的 重金属铅是我们熟知的神经毒物，在环境中普遍存在，因可以引起婴幼儿不可逆的神经系统损害，而备受人们关注。由于血脑屏障没有发育完整，婴儿的血铅水平在达到100μg／L时便可以引起认知功能低下或发育迟缓；在动物模型研究中也发现，低浓度铅暴露同样可以引起动物学习记忆损害，而且损害程度和血铅浓度呈正相关。 人们对铅中毒导致认知损害的机制进行了大量的研究工作，发现铅可以模拟钙的作用，从而改变神经系统的功能；使突触前膜的神经递质谷氨酸释放减少，再摄取增加；抑制NMDAR的激活；干扰PKC和NOS的激活等，尽管如此，铅引起的学习记忆损害的机制至今还没有共识。 CaMKⅡ在脑组织中高度表达，是突触后颗粒(Postsynaptic Density，PSD)中主要的主要成分。通过NMDAR内流的钙可以激活CaMKⅡ，并且可以使该酶的Thr286磷酸化，这种磷酸化可以使它在钙浓度下降情况下依然保持酶的活性。磷酸化的CaMKⅡ可以向突触的PSD移动，并结合到NMDAR，也就是说，钙离子浓度的瞬间升高可以引起该酶的长时间激活和位置的改变，而这些特性被认为是记忆的分子基础。同时人们还发现LTP的诱导和行为学的训练同样可以导致CaMKⅡ的Thr286的磷酸化，提示该酶在突触可塑性和行为学训练中具有非常重要的作用。 1996年English和Swear首先发现MAPK途径在突触可塑性中起着非常重要的作用。他们首先发现NMDAR被激活后可以导致ERK2被激活。在随后的研究中利用ERK2的抑制剂PD98059等，进一步证明该酶的激活为LTP诱导和空间学习记忆等所必需。 尽管许多的实验已经证明CaMKⅡ在学习记忆中具有非常重要的作用，但铅对这该酶的影响却未见报道。本课题组已发现慢性铅中毒可以扰乱正常小鼠脑海马静态ERK2活性变化，但急、慢性铅中毒对脑海马CA1区以及对刺激诱导的ERKZ活性变化的影响却不清楚。本文以CaMKll和ERKZ为核心，在行为学、电生理和信号信号分子三个水平，利用整体和脑片两个模型，以急、慢性两种染毒方式，对铅中毒对的机制进行了综合探讨。为研究学习记忆机制提供有力证据，将铅中毒研究进一步向前推进;为优生优育，提高国民素质，国富民强提供理论依据。材料和方法 体内慢性铅暴露的方法如下:Wistar大鼠购自中国医科大学实验动物中心，被随机平均分为四组。雌雄大鼠自由交配，从幼鼠出生后的第一天开始，母鼠通过饮用含醋酸铅0%、0.022%、0.067%和0.200%的水溶液培养动物。为确使幼鼠具有相同的营养条件，每只母鼠最多哺育10只幼鼠。于Zld开始幼鼠断乳，改为幼鼠直接饮用与母鼠相同铅浓度的水溶液。所有的动物均可自由饮水和获取食物。自第80d开始进行水迷宫实验，接着进行LTP的测定，并取大鼠脑脑海马标本，利用磷酸化抗体，Westem blots方法测定ERI汉和CaMKn活性，利用RT一PcR方法测定CaMKn的mRNA表达水平。 体外急、慢性铅暴露的方法如下:利用颈锥脱臼的方法处死大鼠，迅速取出脑海马，放到预冷并通以95%0:十5%COZ的ACSF中，将脑海马切成350林m的脑片。在稳定培养Zh后，对其进行不同铅浓度和(或)兀A来处理脑片，观察其对脑片ERKZ和 CaMKn活性的影响。结果 1.慢性铅暴露损害大鼠空间学习记忆 在水迷宫定位航行实验中，慢性铅中毒可以明显损害大鼠的定位航行能力，损害的程度与饮用铅的浓度成正相关。在空间搜索的实验中显示铅中毒可以妨碍大鼠的空间搜索策略的形成。 2.慢性铅中毒可以抑制CAI区IJP的形成 为诱导脑海马CAI的LTP，刺激的电极被放置到Sch吐fer侧支，记录电极被放置到CAI。首先利用looHZ的高频刺激55，接着利用同样强度的单刺激刺激SCha且七r侧支，观察高频刺激前后Ps的变化，结果发现不同浓度的铅中毒均可致使脑海马CAI的LTP形成抑制，和对照组相比有显著性差异，但不同的铅中毒组之间没有明显差异。 3.慢性铅中毒对CaMKn活性的影响 对照组的CaMKn活性在出生后迅速升高，到60d时到达最高，至80d时依然维持该水平。低浓度的铅暴露可以使出生后20d大鼠caMKll活性明显升高，和对照组相比有明显差异，随后该酶的活性维持该水平没有太大的变化;而中和高浓度组的酶活性一直维持在较低的水平。 4.慢性铅中毒对CaMKll的mRNA水平影响 为进一步研究慢性铅中毒对CaMKn的mRNA表达水平的影响，利用RT一PCR对其进行了测定，结果发现铅中毒的各组的mRNA水平均明显降低，并具有剂量效应关系。 5.慢性铅中毒对ERKZ活性的影响 对照组的ERKZ活性在出生后迅速升高，于60d时达到最高，随后保持在该水平。低浓度的铅可以使该酶的20d的活性明显升高，和对照组相比有显著性差异，但在随后则保持该水平。而中和高浓度的铅中毒则使该酶的活性一直维持在较低的水平。结果显示铅中毒可以扰乱ERKZ的正常活性变化。 6.TEA对脑海马脑片ERKZ和CaMKn活性的影响 为进一步探讨铅中毒对ERKZ和CaMKll活性影响，利用脑片进行了实验。TEA是另外一种可以诱导脑片LTP的刺激因子。我们发现TEA可以诱导脑片C