第一部分 不同细胞外基质组成的3D多孔支架对富集胶质瘤干细胞样细胞的作用背景与目的:癌干细胞(Cancer stem cells,CSCs)作为具有自我更新能力和异质性的肿瘤起始细胞,其最有可能是肿瘤抵抗、复发和转移的根源。为了进一步研究CSCs在肿瘤生物学中的作用,需要开发有效的培养体系来培养、维持和富集CSCs。三维(3D)细胞培养模型已广泛应用于肿瘤的研究和药物筛选。目前,已有多种材料组成的3D模型应用于CSCs富集的研究中。然而,哪种材料成分更有利于富集CSCs还不是很清楚。本文第一部分采用3D多孔壳聚糖(Chitosan,CS)支架和壳聚糖-透明质酸(Chitosan-hyaluronic acid,CS-HA)支架来培养胶质瘤细胞系U87,探讨胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)样细胞富集的可能,并与二维(2D)培养进行对比,研究不同细胞外基质组成的3D支架中细胞的形态、增殖、基因表达和致瘤性。方法:1.分别配制CS溶液和CS-HA溶液,冷冻干燥后得到3D多孔CS及CS-HA支架,伽马射线辐照灭菌备用。2.使用CCK-8试剂分析支架的细胞毒性,通过浸渍法测定支架的孔隙率及溶胀性。3.将胶质瘤细胞U87分别接种于CS和CS-HA支架上,使用荧光活/死染色试剂和阿尔玛蓝试剂来评估细胞在支架上的活性及增殖能力,采用苏木精和伊红染色(HE)及扫描电镜来观察细胞在支架内部及2D培养下的形态结构。4.免疫荧光染色分析U87细胞在不同培养条件下的胶质瘤干细胞表面标记物CD133和Nestin的表达,通过qRT-PCR分析不同培养条件下U87细胞中CD44、HIF-1α、Snail、CD133、Nestin的基因表达,流式细胞术分析3D支架和2D培养条件下U87细胞中CD133+细胞的比例。5.从2D培养和3D多孔支架上收获肿瘤细胞,分别接种于裸鼠皮下,观察肿瘤的发生及体积变化,接种6周后收集移植瘤标本行HE染色及CD31、Ki67免疫组织化学检测。结果:1.冷冻干燥后得到的CS和CS-HA支架的平均直径为13±0.8mm,厚度为2±0.5mm。2.两种支架在冻干后都具有良好的孔隙率,CS支架的孔隙率为90±3%,孔径大小为98.37±5.57μm,孔隙不规则;CS-HA支架的孔隙率为86±2%,孔径大小为94.13±3.67μm,孔隙规则。CS和CS-HA支架均无细胞毒性,适合细胞生长,两种支架都具有良好的吸水性且CS-HA支架的溶胀能力高于CS支架。3.U87细胞在CS和CS-HA支架上均具有良好的细胞活性,与传统的2D培养相比,细胞在3D多孔支架上的增殖更加稳定。3D支架中的U87细胞逐渐形成多细胞簇并聚集成肿瘤细胞球,而2D平皿上的肿瘤细胞呈上皮样形态生长。4.与2D培养相比,CS和CS-HA支架中CD133和NestinmRNA含量提高,在培养的第10天,CD133和Nestin在CS-HA支架中的相对表达量高于CS支架。此外,CS-HA支架中上皮-间质转化(EMT)相关基因CD44、HIF-1α和Snail的表达高于CS支架,GSC样细胞的比例高于2D单层培养和CS支架培养。5.CS-HA和CS支架培养的肿瘤细胞在裸鼠皮下致瘤率分别是100%和80%,明显高于2D的40%,且3D培养的细胞形成的肿瘤体积明显大于2D培养细胞。结论:与2D培养相比,CS和CS-HA支架均能较好地模拟胶质瘤肿瘤微环境,3D多孔支架促进了细胞与细胞及细胞与细胞外基质的相互作用。特别是与HA结合后能够诱导激活下游的信号通路。CS和CS-HA支架培养不仅能够促进肿瘤细胞球的形成,而且与2D单层培养相比,两种支架都具有富集GSC样细胞的能力,尤其是CS-HA支架培养。第二部分 3D生物打印载胶质瘤细胞水凝胶支架富集胶质瘤干细胞样细胞的研究背景与目的:胶质瘤干细胞(GSC)被认为是胶质瘤复发、进展和放化疗抵抗的根源。GSC占胶质瘤细胞总数的比例不足1%,建立一个培养和富集GSC的理想体外模型有助于进一步深入研究GSC的生物学行为。本文第二部分利用3D生物打印技术构建载胶质瘤细胞系U118的明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原水凝胶支架来富集GSC样细胞。评价3D生物打印支架中肿瘤细胞的活性、形态、增殖以及GSC标记物和上皮-间质转化(EMT)相关基因的表达并与2D进行比较,最后分析不同培养条件下的肿瘤细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性和体外致瘤性的差异。方法:1.配制质量体积分数分别为4%海藻酸钠、20%明胶和4%纤维蛋白原溶液,再将细胞悬液按体积比为1:1:2:1与之分别混合,得到终浓度为1%海藻酸钠、10%明胶和1%纤维蛋白原的打印材料,将配制好的材料装入1mL注射器,置于打印机挤出卡槽中。2.使用生物打印机(LivPrint TM)打印宽度为15 ×15mm,厚度为1mm的网格状水凝胶支架。3.使用荧光活/死染色试剂和阿尔玛蓝试剂来评估细胞在水凝胶支架上的活性及增殖能力,采用HE染色及扫描电镜来观察细胞在水凝胶支架中及2D培养下的形态结构。4.免疫荧光染色分析U118细胞在3D和2D条件下的胶质瘤干细胞表面标记物CD133和Nestin的表达,通过qRT-PCR分析不同条件下培养的U118细胞中Twist1、HIF-1α、Snail、VEGF、CD133、Nestin的基因表达,流式细胞术分析3D水凝胶支架和2D培养条件下U118细胞中CD133+细胞的比例。5.将药物浓度为0、200、400、800、1600μg/mL的替莫唑胺溶液加入到两种不同条件下培养的肿瘤细胞中孵育48小时,用阿尔玛蓝试剂来检测细胞的活性。6.从2D培养和3D水凝胶支架上收获肿瘤细胞,分别接种于裸鼠皮下,观察肿瘤的发生及体积变化,接种6周后收集移植瘤标本行HE染色及CD31、vWF免疫荧光检测。结果:1.3D生物打印的具有内部互通结构的水凝胶支架有利于营养物质和代谢废物的交换,即使培养到第15天,水凝胶支架仍保持良好的形态结构。2.打印后即刻的细胞存活率为89.06±3.58%,培养15天后的细胞存活率为84.30±2.67%,U118细胞在传统的2D培养下呈单层扁平状生长,而在3D打印水凝胶支架中逐渐聚集形成肿瘤细胞球。2D培养条件下的细胞在第1天至第5天快速增殖,5天后增殖变慢,10天后细胞增殖快速下降,而3D生物打印水凝胶支架中的细胞增殖逐渐上升,15天后细胞增殖趋于稳定。3.3D水凝胶支架中胶质瘤干细胞标记物CD133和Nestin及EMT相关基因HIF-1α,Snail,Twist和VEGF的mRNA含量高于2D培养,且流式检测结果提示3D培养的U118细胞中CD133比例高于2D培养。4.3D生物打印培养的细胞比2D细胞具有更强的耐药性。5.相对于2D培养,3D水凝胶支架中培养的肿瘤细胞具有更高的致瘤率和形成更大的肿瘤体积,且血管生成能力更强。结论:与常规2D培养相比,3D生物打印的肿瘤模型可以更好地模拟体内肿瘤微环境,构建的载胶质瘤细胞水凝胶支架能够富集胶质瘤干细胞样细胞,且培养的胶质瘤细胞在体外具有更强的耐药性和体内致瘤性。第三部分 3D生物打印胶质瘤干细胞促进其血管化能力背景与目的:胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种高度恶性的原发性脑肿瘤,其重要特征之一是血管化程度高。研究表明,肿瘤内存在的胶质瘤干细胞参与了肿瘤血管的生成。然而,体内外研究GBM血管生成所需的GSC大多是在无血清培养基中做悬浮培养得到,悬浮培养时GSC分泌的血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)分散于培养基中,不利于发挥细胞的旁分泌和自分泌功能,且悬浮培养不能很好的模拟GSC所需要的三维微环境。本文第三部分利用3D生物打印技术构建GSC水凝胶模型,分析3D培养的GSC的细胞活性、增殖能力和形态结构,检测GSC分泌的VEGFA水平及体外血管化能力和肿瘤血管生成相关基因的表达,并与传统悬浮培养进行对比。方法:1.配制质量体积分数分别为4%海藻酸钠、20%明胶和4%纤维蛋白原溶液,再将细胞悬液按体积比为1:1:2:1与之分别混合,得到终浓度为1%海藻酸钠、10%明胶和1%纤维蛋白原的打印材料。2.使用生物打印机(LivPrintTM)打印直径为15mm,厚度为1mm的圆形网格水凝胶支架。3.使用荧光活/死染色试剂和阿尔玛蓝试剂来评估细胞在水凝胶支架上的活性及细胞增殖能力,采用苏木精和伊红染色、扫描电镜及透射电镜来观察细胞在3D水凝胶支架中和悬浮培养下的形态结构。4.使用ELISA试剂盒检测胶质瘤干细胞GSC23在3D水凝胶和悬浮培养条件下VEGFA分泌量,通过qRT-PCR分析不同培养条件下GSC23中CD31、VEGFR2和CD133的基因表达,流式细胞术分析3D水凝胶支架和悬浮培养条件下GSC23中CD133+细胞的比例。5.收集来自悬浮培养和3D水凝胶支架中的GSC23,接种在Matrigel胶包被的孔板上,显微镜下观察由GSC23形成的管状结构。结果:1.3D生物打印的具有多孔通道的水凝胶支架有利于营养物质和代谢废物的交换,即使培养到第15天,水凝胶支架仍保持良好的形态结构。2.打印后即刻的细胞存活率为86.27±2.41%,培养15天后的细胞存活率为89.39±1.86%。GSC23细胞在传统的悬浮培养下逐渐由团簇状生长变成片状生长,而3D打印水凝胶支架中的GSC23细胞逐渐聚集形成肿瘤细胞球。悬浮培养的细胞增殖从第1天到第5天显著增加,第5天后增殖速率迅速下降。而3D打印支架中的细胞增殖逐渐增加,在第10天达到高峰,之后的增殖趋于稳定。3.悬浮培养中VEGFA的含量在初始的7天内逐渐增加,然后缓慢下降。而3D生物打印水凝胶支架中的VEGFA含量逐步增加,在培养9天后其含量趋于稳定。4.3D水凝胶支架中的CD31、VGGFR2和CD133 mRNA的表达量高于悬浮培养,且流式检测结果提示CD133表型细胞的比例高于悬浮培养。5.与悬浮培养相比,3D生物打印培养的GSC23细胞形成的管状结构更为明确,网格数量更多。6.悬浮培养的GSC23的微绒毛不发达,而3D生物打印支架中培养的GSC23的微绒毛长且数量众多。此外,3D水凝胶支架中的GSC23具有丰富的线粒体和粗面内质网。结论:3D生物打印的水凝胶支架所提供的微环境不仅能够促进细胞生长和增殖,还影响了细胞的形态和生物学行为。与传统的GSC悬浮培养相比,3D水凝胶培养的GSC的干细胞性能、肿瘤血管生成相关基因的表达及体外血管化能力都有提高。第四部分 同轴生物打印壳-芯水凝胶微纤维模拟胶质瘤微环境并增强肿瘤细胞耐药性的研究背景与目的:虽然化疗可以进一步杀灭胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)手术后残留的肿瘤细胞,但肿瘤细胞的耐药性会导致GBM的复发。实现一个理想的用于药物评估的肿瘤模型仍具有挑战性,其主要原因归结于无法很好的模拟体内肿瘤微环境。肿瘤微环境由肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞和间充质细胞等组成,其中肿瘤干细胞在肿瘤的发生、进展、复发和耐药中起关键作用。肿瘤干细胞与肿瘤微环境的相互作用共同促进肿瘤的发展。目前,用生物打印平台构建的胶质瘤模型大多仅包含胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞的其中一种。构建由胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞组成的模型有助于模拟胶质瘤微环境和胶质瘤细胞生物学行为及耐药性的研究。本文第四部分利用同轴挤出生物打印技术构建了壳-胶质瘤干细胞/芯-胶质瘤细胞水凝胶微纤维,分析了壳-芯水凝胶微纤维的中细胞活性和形态,评估了水凝胶微纤维中与耐药性相关基因的表达。此外,体外研究了在不同条件下培养的胶质瘤细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性。最后,分析了水凝胶微纤维中的胶质瘤细胞耐药性增强的机制。方法:1.配制质量体积分数为3%海藻酸钠溶液,将胶质瘤干细胞GSC23与3%海藻酸钠溶液混合得到同轴打印所需的壳-材料,将胶质瘤细胞U118重悬于培养基中得到打印所需的芯-材料。用定制的同轴打印装置打印壳-GSC23/芯-U118和壳/芯-U118水凝胶微纤维。2.使用活/死试剂和阿尔玛蓝试剂来评估打印后细胞的活性及增殖能力,采用苏木精和伊红(HE)染色及扫描电镜来观察细胞在水凝胶微纤维中的形态结构。3.通过qRT-PCR分析不同培养条件下U118细胞中MMP9、MMP2、MGMT和VEGFR2的基因表达,Western blot检测与肿瘤耐药性相关的MMP9和MGMT蛋白表达。4.将药物浓度分别为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL 的替莫唑胺溶液加入到两种不同条件下培养的U118细胞中孵育48小时,用阿尔玛蓝试剂来检测细胞的活性。5.采用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)法评估不同条件下培养的U118细胞中DNA甲基化率。结果:1.使用同轴生物打印平台构建的壳-芯水凝胶微纤维的内径和外径分别是407.36±11.42μm和867.53±12.28μm。2.同轴打印后2小时的细胞存活率为93.72±2.51%,培养15天后,壳-芯水凝胶微纤维内的细胞仍保持90.63±1.54%的高存活率。HE染色显示GSC23细胞被包裹在壳中,芯内充满U118细胞团,扫描电镜进一步揭示海藻酸钠外壳包裹并支持U118细胞形成肿瘤细胞球。培养过程中,细胞在水凝胶微纤维内增殖稳定。3.与壳/芯-U118水凝胶微纤维相比较,壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维中U118细胞的MMP9、MMP2、MGMT和VEGFR2的mRNA表达明显提高,且与肿瘤耐药性相关的MMP9和MGMT蛋白表达也显著增高。4.随着TMZ浓度的增加,肿瘤细胞活力逐渐下降,而与壳/芯-U118水凝胶微纤维培养的细胞相比,壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维培养的细胞显示出更强的生存能力,这表明壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维中培养的U118细胞具有更强的药物耐受性。5.壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维培养的U118细胞中的MGMT基因的甲基化率为18.95%,而壳/芯-U118水凝胶微纤维中的MGMT甲基化率为40.26%,肿瘤细胞中的MGMT甲基化程度越高,肿瘤的耐药性越低。结论:使用同轴挤出生物打印构建的壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维能够很好的模拟胶质瘤微环境,与壳/芯-U118水凝胶微纤维相比,壳-GSC23/芯-U118微纤维中与肿瘤侵袭和耐药相关基因的表达显著增强,且U118细胞在体外具有更高的耐药性。壳-GSC23/芯-U118水凝胶微纤维肿瘤模型为药物的开发和筛选提供了一个良好的平台。