为了有效克服转基因家蚕可能带来的生物安全问题，本论文首先建立了基于FLP/FRT位点特异性重组系统的家蚕转基因定点删除技术，利用该技术可实现对转基因家蚕基因组中筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除，从而有效克服筛选标记基因的保留所带来的潜在生物安全隐患;随后建立了基于phiC31整合酶介导的盒式交换(phiC31-RMCE)系统的家蚕转基因定点整合技术，利用该技术可实现不同外源基因在转基因家蚕基因组预先建立靶位点的定点整合，从而有效消除转座子随机整合位置效应对外源基因表达的影响;最后联合位点特异性重组系统及改造的复合型piggyBac转座载体，开发了一项通用且有效的转基因在家蚕基因组稳定整合、表达以及可精确替换的策略，并利用该策略成功地建立了一种稳定、可置换型高效转基因家蚕丝腺表达系统。论文获得的主要研究结果如下:　　1.家蚕转基因定点删除技术的建立　　通过胚胎显微注射，首先筛选并建立了1个FLp/FRT系统转基因靶品系（Transgenic targetstrain，TTS）。分子鉴定结果显示，TTS家蚕基因组中含有单拷贝的被FRT位点锚定的A3-EGFP-SV40表达框。通过胚胎显微注射FLP基因mRNA或重组酶瞬时表达载体pSLA3-FLP的方式引入FLP重组酶的表达，在TTS家蚕后代蛾圈中成功筛选到了A3-EGFP-SV40表达框被定点删除的位点特异性重组品系(Site-specific recombination strain，SSRS)家蚕个体。统计结果显示，通过注射mRNA获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率(13.3％)要明显高于注射pSLA3-FLP获得阳性蛾圈的概率(2.38％)。　　随后同样通过胚胎显微注射，分别筛选并建立了1个利用家蚕肌动蛋白Actin3基因启动子调控FLP重组酶表达(A3-FLP)的重组酶表达辅助品系(H-A-1)和1个利用果蝇hsp70基因启动子调控FLP重组酶表达(Hsp70-FLP)的重组酶表达辅助品系（H-H-1），期望通过将TTS家蚕与H-A-1家蚕杂交的方式，在TTS&H-A-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达，以实现A3-EGFP-SV40表达框在TTS&H-A-1家蚕后代的高效删除;期望通过将TTS家蚕与H-H-1家蚕杂交并进行42℃热激处理（Heat shock treatment，HST）的方式，在TTS&H-H-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达，以实现A3-EGFP-SV40表达框在TTS&H-H-1家蚕后代的可诱导删除。在进行杂交实验之前，首先检查了FLP重组酶在H-A-1和H-H-1家蚕体内的表达情况。RT-PCR和qRT-PCR结果显示，FLP重组酶在H-A-1家蚕的脂肪体、中肠、丝腺、精巢、卵巢和胚胎等组织中均能高效表达;而通过42℃热激处理能够使FLP重组酶在H-H-1家蚕上述各组织中的表达水平显著上调，其中在精巢、卵巢和胚胎中的表达水平上调了58.2％～72.3％。　　统计分析结果显示，通过有性杂交引入FLP重组酶的方式，在TTS&H-A-1家蚕后代蛾圈中筛选获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率达到了97.01％～100％;经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率(32.14％～36.67％)要显著高于未经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率(2.63％～6.67％)。随后，分别提取TTS家蚕和SSRS家蚕的基因组进行分子鉴定，鉴定结果显示位点特异性重组事件精确地发生于TTS家蚕基因组2个FRT位点之间，重组反应没有引起任何的突变或染色体结构变异。　　利用上述研究的策略和方法，可实现对转基因家蚕筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除，从而有效地消除筛选标记基因在转基因家蚕基因组的保留对基因功能研究带来的影响及潜在的生物安全隐患。　　2.家蚕转基因定点整合技术的建立　　通过胚胎显微注射，首先分别筛选并建立了1个基因组中含有attP/attP位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-P和1个基因组中含有attB/attB位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-B。分子鉴定结果显示，TTS1-P和TTS1-B家蚕基因组中分别含有单拷贝的attP/attP和attB/a ttB位点对，插入位点分别定位于第20号（常染色体）和第1号（Z染色体）染色体。通过先回交再自交的制种方式，将TTS1-P和TIS1-B家蚕连续培养7代，最终获得了纯合的G8代TTS8-P雄蛾与雌蛾（基因型分别为+A+A♂和+A+A♀，字母“A”表示转基因，下同），以及纯合的G8代TTS8-B雄蛾(ZAZA♂)与杂合的G8代TTS8-B雌蛾(ZAW♀)。　　通过显微注射将phiC31整合酶mRNA或整合酶瞬时表达载体pSLA3-Int以及相应的含有被attB位点或attP位点锚定的3×P3-EGFP表达框的供体质粒(pSL{attB1-3×P3-EGFP-SV40-attB2}或pSL{attP1-3×P3-EGFP-SV40-attP2））导入TTS9-P或TTS9-B家蚕胚胎，在TTS10蛾圈中筛选获得含有位点特异性整合品系(Site-specificintegration strain，SSIS)家蚕（SSIS1-P或SSIS1-B）的阳性蛾圈的概率为3.84％～7.01％。分子鉴定结果显示，3×P3-EGFP表达框在筛选到的所有SSIS1-P和SSIS1-B家蚕中，均是通过RMCE反应整合至基因组靶位点。统计结果显示，转基因蚕染色体上的attP/attP靶位点对和供体质粒上的attB/attB位点对之间的RMCE效率，比转基因蚕染色体上的attB/attB靶位点对和供体质粒上的attP/attP位点对之间的RMCE效率高。荧光筛选和分子检测结果证实，位点特异性整合的转基因在SSIS家蚕后代基因组中能够稳定的遗传和表达。　　利用本研究建立的phiC31-RMCE系统可介导外源基因在转基因家蚕基因组预先建立的靶位点的定点整合，从而有效克服转座子介导外源基因随机整合位置效应对转基因表达及基因功能研究带来的影响。　　3.一种稳定、可置换的安全高效家蚕转基因操作技术的建立　　构建含有4个转座子臂序列（L1、L2、R1和R2）、转座酶基因表达框(Hsp70-PBase-SV40)、筛选标记基因（3×P3-DsRed和3×P3-EGFP）及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框的复合型piggyBac转座载体PB-TP。通过显微注射将PB-TP与转座酶表达辅助载体pHA3PIG共同导入非滞育的871品系G0代家蚕受精卵，筛选并建立了4个同时含有3种不同荧光表型（3×P3-DsRed，用R表示;FibH-EGFP，用g表示;3×P3-EGFP，用G表示）的G1代转基因品系TS1-RgG1-TS1-RgG4。分子鉴定结果显示，TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中均含有单拷贝的4个完整转座子臂结构及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列，其中TS1-RgG2家蚕茧丝中的外源蛋白表达量最高，纯EGFP蛋白占茧丝总蛋白含量(w/w)的16％以上。　　将TS1-RgG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的G2代蚕卵分为3组，1＃组正常饲养用作对照，剩下2组分别在胚胎发育阶段（2＃组）和幼虫发育阶段（3＃组）进行42℃热激处理。从成活的G2代蚕蛾中筛选同时含有3种荧光表型的TS2-RgG2转基因蚕蛾，将其与871回交产生G3代蚕卵，在G3代幼虫中筛选仅含有FibH-EGFP荧光表型（g表型）的TS3-g2家蚕个体，并统计含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率。统计结果显示，从2＃组和3＃组中筛选到含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率分别为16.22％(6/37)和2.22％(1/45)，而在未经热激处理的1＃组中并没有筛选到含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈。分子鉴定结果显示，TS3-g2家蚕基因组中保留了完整的被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列，而不再含有任何的转座子元件序列。piggyBac转座子的再转座没有引起切除的TTAA位点或attP位点附近的DNA序列发生任何突变或染色体结构变异。　　统计分析结果显示，在胚胎发育阶段进行42℃热激处理的实验组中筛选获得含有TS5-g2家蚕的阳性蛾圈的概率最高，达到了70％～80％。该结果证实，在转基因家蚕胚胎发育阶段，利用42℃进行持续且反复多次的热激处理，是实现转座子序列在其后代家蚕基因组中删除的最有效方法。　　利用上述方法不但能够有效消除piggyBac转座子介导外源基因在家蚕基因组整合的不稳定现象和筛选标记基因、转座子骨架序列保留所带来的生物安全隐患，而且还能够利用位于目的基因表达框两端的2个同向排列的attP位点，通过phiC31-RMCE反应实现不同的待研究外源基因在相同整合位点的定点整合，从而有效克服随机整合位置效应对转基因表达和基因功能研究的影响。此外，本研究建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的策略，也同样适用于其他种类鳞翅目昆虫，可应用于提高转基因昆虫生态安全的生物防控研究领域。