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第一部分miR-145调控过氧化氢介导的心肌细胞凋亡的机制研究目的:研究miR-145对过氧化氢(H202)介导的心肌细胞凋亡的调控作用及其机制;探讨miR-145的表达与心肌缺血-再灌注损伤的相关性。方法:1、采用胰酶联合胶原酶消化的方式从新生大鼠(1d～3d)的心脏组织中获得心肌细胞(NRCM);加入H202刺激,实时定量PCR法检测刺激不同时间点的心肌细胞中成熟miR-145的水平。2、利用雄性10周左右的C57小鼠手术诱导心肌缺血-再灌注。取缺血区周边心肌组织,实时定量PCR法检测其中成熟miR-145的水平。3、体外心肌细胞中利用腺病毒诱导预先过表达miR-145,加入H202刺激,检测凋亡有关的指标如 DNA ladder 和 TUNEL;Western blot 检测 cleaved caspase3、Bnip3、Cytochrome C等与凋亡相关的信号分子水平;透射电镜下观察心肌细胞线粒体的形态;DCFH-DA荧光染色观察心肌细胞中活性氧自由基(ROS)的水平。4、分别构建表达Bnip3CDS及Bnip3CDS+3’UTR的质粒载体,用于转染过表达miR-145的心肌细胞,加入H202刺激,检测DNA ladder、TUNEL;电镜下观察心肌细胞线粒体形态;荧光染色观察ROS水平。5、Western blot检测miR-145对Bnip3表达水平的影响;构建包含miR-145预测结合序列及其突变序列的Bnip3 3’UTR的荧光素酶报告基因载体,利用荧光素酶报告基因试验验证miR-145对Bnip3的靶向调控作用。结果:1、分离得到的NRCMs,在50μMH2O2刺激0.5、1、2、4、8小时成熟miR-145的水平均显著低于静息状态。2、缺血-再灌注1小时及3小时的小鼠心肌组织中miR-145的表达水平较假手术组均显著降低。3、DNA ladder及TUNEL荧光染色均显示过表达miR-145显著降低了 H2O2刺激下心肌细胞的凋亡率;western blot结果显示,除cleaved caspase3变化不明显外,p-p53、Apaf-1及线粒体Bnip3水平均可被miR-145剂量依赖性地下调,过表达miR-145可抑制cytochrome C从线粒体向胞质释放;电镜见在H2O2刺激下miR-145能显著保护心肌细胞线粒体的结构破坏;DCFH-DA荧光染色见H2O2刺激下miR-145能显著降低心肌细胞中ROS水平。4、在过表达miR-145及H202刺激的心肌细胞中预先过表达Bnip3CDS能显著增加细胞的凋亡率、ROS的水平;而预先过表达Bnip3CDS+3’UTR对上述指标无明显影响;过表达Bnip3CDS促进了心肌细胞线粒体的形态结构紊乱。5、Western blot结果显示miR-145剂量依赖性地下调Bnip3的表达水平;荧光素酶报告基因试验显示Bnip3的3’UTR受到miR-145的靶向调控。结论:miR-145可通过下调线粒体凋亡诱导因子Bnip3的表达,抑制体外H2O2诱导的心肌细胞凋亡,降低心肌细胞氧化应激损伤,减轻线粒体的结构破坏;miR-145的表达异常与心肌缺血-再灌注损伤相关。第二部分miR-145调控异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的机制研究目的:研究miR-145对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞肥大的调控作用及其机制;探讨miR-145的表达与后负荷增高引起的心肌肥大的相关性。方法:1、分离新生大鼠(ld～3d)的心肌细胞(NRCM)。加入ISO处理,检测刺激不同时间点的心肌细胞中成熟miR-145的水平;检测上述时间点的心肌细胞中GATA6以及转录因子p53、C/EBP-β、FOX03a等蛋白水平。2、手术缩窄小鼠主动脉弓段以构造后负荷增高导致的心肌肥大动物模型(TAC),检测手术后1周、4周模型和对照小鼠左心室组织中miR-145表达水平。3、利用腺病毒载体在体外心肌细胞中高表达miR-145,用ISO刺激,实时定量RCR检测与肥大相关的胚胎基因ANF、BNP及β-MHC的表达;同位素硫35标记半胱氨酸检测细胞摄取氨基酸水平,反映心肌细胞蛋白合成能力;用心肌特异性的sarcomeric actin的抗体对细胞行荧光染色,观察心肌细胞的体积。4、构建GATA6过表达质粒载体,转染心肌细胞,观察miR-145对ISO诱导的胚胎基因表达、蛋白合成增加以及细胞体积增大的作用能否被过表达GATA6逆转。5、Western blot检测与心肌细胞肥大相关的经典信号通路Akt-mTOR、Akt-GSK3β、ERK1/2、JNK、p38通路中重要信号分子及其磷酸化产物的水平,寻找受miR-145调控的信号通路。6、细胞免疫荧光观察miR-145对GATA6在心肌细胞中的定位的影响;分离细胞浆蛋白和核蛋白,Western blot检测各自中GATA6的水平。7、利用GSK3β的抑制剂LiCl和TDZD8分别作用心肌细胞,Western blot检测细胞浆蛋白和核蛋白中GATA6的水平。观察阻断GSK3β能否逆转miR-145对GATA6定位的影响。8、Western blot检测单纯miR-145过表达对GATA6表达水平的影响;构建含有miR-145结合位点及其突变位点的GATA6的3’UTR荧光素酶报告基因载体,利用荧光素酶报告基因试验验证GATA6是miR-145直接作用的靶基因。结果:1、ISO刺激心肌细胞后4和8小时,miR-145水平均显著升高,4小时达峰值,12和24小时较基础水平无显著改变;GATA6的蛋白水平在ISO刺激后4、8、12、24小时均显著升高;p53和C/EBP-β在ISO刺激后不同时相升高,FOXO3a蛋白水平无明显改变。2、TAC手术后1周小鼠左室心肌组织中miR-145的表达显著高于假手术组;TAC术后4周小鼠左室心肌组织中miR-145的表达水平较假手术组无显著差异。3、腺病毒介导的miR-145过表达显著降低了 ISO诱导的胚胎基因ANF、BNP、β-MHC的表达;降低ISO刺激下心肌细胞的蛋白合成率及细胞体积。4、在过表达miR-145以及ISO刺激的情况下,过表达GATA6能逆转miR-145在心肌细胞中的作用,表现在:显著升高心肌细胞中ANF、BNP、β-MHC的表达,提高蛋白合成率,以及增大细胞体积。5、miR-145显著升高了 ERK1/2、JNK的磷酸化产物水平,降低了 p38、Akt的磷酸化水平(主要是S473位点),降低了 Akt下游mTOR、GSK3β、p70S6K等分子的磷酸化水平,降低了细胞总蛋白GATA6、GATA4的水平。6、细胞免疫荧光试验和western blot结果均显示miR-145明显抑制ISO诱导的GATA6的核聚集。7、GSK3β抑制剂LiCl和TDZD8均能显著增加GATA6的核移位,拮抗miR-145对GATA6定位的影响。8、GATA6能被miR-145剂量依赖性地下调,而GATA4不能被单纯过表达miR-145降低;荧光素酶报告基因试验证明,GATA6的3’UTR受miR-145直接的靶向调控。结论:miR-145可通过下调转录因子GATA6的表达,抑制体外ISO诱导的心肌细胞肥大;miR-145能通过抑制Akt-GSK3β通路,抑制GATA6从细胞质向细胞核移位;miR-145的异常表达与后负荷增高引起的心肌肥大相关。