目前,临床上应用最广泛的肝癌血清标志物是AFP,而AFP诊断肝癌具有局限性,因而亟待探索发现新的有价值而实用的标志物。2013年,James E. Rothman, Randy W. Schekman, Thomas C因发现细胞囊泡运输的调节机制,揭开细胞内的运输机制之谜而荣获了当年诺贝尔生理学或医学奖。作为人体内一类重要囊泡,外泌体(exosomes)已成为生物标志物研究热点。由于外泌体中含有的特有蛋白质、脂质、RNA、microRNA等活性物质,在细胞通讯、细胞迁移等方面发挥重要作用。目前已从外泌体中发现多种生物标志物,如检测外泌体中EGFR、MET、ALK和BRAF可作为肺癌标志物,这为肝癌生物标志物的研究提供了新思路。由于蛋白质是生命功能的直接体现者,蛋白质组学在蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等大规模水平上研究蛋白质的特征,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。对处于探索阶段的外泌体研究来说,关于外泌体蛋白质组学的研究目前还很少报道。为此,本研究探讨适合肝癌细胞外泌体分离的新方案,通过改良超离法分离纯化肝癌细胞SMMC-7721、正常肝细胞HL-7702、肝癌血清和正常对照血清的外泌体,并从形态学和特异蛋白等方面进行鉴定；利用LC-MS/MS质谱技术分析鉴定肝癌细胞及其外泌体主要蛋白,并进行相关功能分析,为肝癌细胞外泌体进一步研究提供研究基础。第一章 改良超速离心法提取肝癌细胞外泌体及鉴定目的探索肝癌细胞和血清外泌体的提取和鉴定方法,为外泌体的标志物的研究提供基础。方法连续适应无血清培养肝癌SMMC-7721细胞,收集细胞上清液,采用ExoQuick试剂法、ExoQuick试剂结合超滤法和改良超速离心法三种方法分离、纯化培养上清液中肝癌细胞外泌体；ExoQuick试剂法和超速离心法提取血清外泌体；透射电镜观察外泌体形态,Nanosight技术分析粒径,Western blot分析外泌体特异蛋白Alix、CD63、CD9的表达；利用SDS-PAGE电泳分析肝癌细胞和血清外泌体的蛋白谱。结果采用ExoQuick试剂法和ExoQuick试剂结合超滤法提取的外泌体浓度低、纯度差；改良超速离心法可分离出纯度高的外泌体,透射电镜观察肝癌细胞外泌体,外形呈圆形或椭圆形；Nanosight技术分析外泌体颗粒直径峰值为122 nm,直径30-150 nm之间颗粒占72.16%；Western blot证实在细胞培养上清液和外泌体提取液中均能检测到Alix、CD63、CD9的蛋白表达；SDS-PAGE电泳清晰显示外泌体中高丰度大分子结构蛋白明显少于肝癌细胞和血清。结论利用连续适应无血清细胞培养结合改良超速离心法能提取高纯度的外泌体,肝癌细胞外泌体中高丰度大分子结构蛋白干扰少,有利于标志物的研究。第二章肝癌细胞外泌体蛋白质组学研究目的LC-MS/MS质谱技术蛋白组学分析鉴定肝癌细胞SMMC- 7721及其外泌体的主要蛋白,生物信息学分析其功能。方法分离和纯化肝癌细胞SMMC-7721外泌体,通过LC-MS/MS质谱技术分析鉴定肝癌细胞SMMC- 7721及其外泌体的主要蛋白,筛选共同表达蛋白；运用DAVID系统对共同表达蛋白进行GO分类分析和信号传导通路分析；运用String系统对共同表达蛋白进行网络蛋白相互作用分析。结果经人类uniprot数据库检索鉴定,采用高置信度的肽段(大于95%),检出肝癌SMMC-7721细胞蛋白4922个,SMMC-7721外泌体蛋白1568个,两者共同蛋白1035个,其中肽谱图匹配数PSMs>40的相对高表达蛋白70个；在70个蛋白中外泌体膜蛋白有4个,分别为肌球蛋白9(Myosin-9,MYH9),视黄酸诱导的蛋白3(Retinoic acid-induced protein 3, GPRC5A),整合素β-1 (Integrin beta-1, ITGB1),人源重组蛋白(Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2, GALNT2);70个蛋白分类分析显示,大部分蛋白属于细胞器或膜蛋白类(31%)、结合类(60%)及转移／载体蛋白类(28%)；对70个蛋白进行信号通路分析,富集出与肝癌有关重要信号传导通路2条,分别为基因剪切通路(Spliceosome)和在癌症通路(Pathways in cancer); String分析70个蛋白相互作用,显示功能节点蛋白为DHX9、PRKDC、HSP90AA1、ITGB1、AGRN、RUVBL1、EEF2等。结论肝癌SMMC-7721细胞及其外泌体具有共同表达蛋白,其中外泌体所含有的膜蛋白,与肝癌有关的2条重要信号传导通路,以及蛋白相互作用中重要的节点蛋白是下一步研究的重点。