水稻是重要的粮食作物，感染稻瘟病后，会严重影响水稻的产量和品质。据估计，全球每年由稻瘟病引起的损失为50亿美元。实践证明，培育和合理利用抗病品种是控制这一病害最经济有效和对环境最安全的途径。然而，往往具有单一抗病基因的水稻品种在广泛种植了一段时间以后就丧失了抗病性。因此，对稻瘟病的防治一般从两方面着手，一方面需不断地发掘和创造新抗源；另一方面，抗病基因是植物-病原物互作中的一个关键因子，克隆抗病基因是研究植物抗病机制、揭示植物-病原物互作机理和了解寄主与病原菌共进化规律的基础，从而为控制和防治该病害提供新的理论与途径。 水稻稻瘟病抗病基因Pi37对大部分采自中国的菌株具有广谱的抗病性，在前期的研究中，Chen等(2005)利用微卫星(simplesequencerepeat，SSR)和序列标签位点(sequencetaggedsite，STS)标记将Pi37定位在第1染色体上约0.77cM的区间里，其中有4个标记与之完全共分离。同时，利用参考品种日本晴的细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)和P1介导的人工染色体(P1-derivedartificialchromosome，PAC)克隆，通过生物信息学分析(bioinformaticsanalysis，BIA)，构建了该位点的电子物理图谱，把Pi37位点界定在大约374kb的区段内。为了进一步对该抗病基因进行克隆和功能分析，本研究主要进行了以下几个方面的工作： (1)Pi37候选基因的预测注释及RT-PCR分析 为了确定Pi37的候选基因，根据日本晴的参考序列，利用3种生物信息学软件ORFFinder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)、RiceGAAS(Autopredgeneset，http：//ricegaas.dna.affrc.go.jp)系统和SoftBerry(http：//www.softberry.com)系统对Pi37基因所在区域进行了基因预测。结果表明，在该区域内只有4个候选基因具有抗病基因保守结构，即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotidebindingsite-leucine-richrepeat，NBS-LRR)。为了进一步确定Pi37的候选基因，利用RT-PCR(reversetranscriptionPCR)技术，对4个具NBS-LRR保守结构的候选基因进行了表达分析。结果表明，这4个候选基因都是组成型表达的基因。由此确定了Pi37的4个候选基因，Pi37-1，Pi37-2，Pi37-3，Pi37-4。 (2)候选基因的克隆及序列分析 为了充分地了解抗感品种在候选基因位点上的序列差异，利用长片段LR-PCR(1ong-rangePCR)技术，及双元载体pCAMBIA1300克隆技术，分别对4个候选基因进行了扩增、克隆和测序，然后利用生物信息学分析工具，分别在基因组、cDNA和氨基酸序列水平上，对4个候选的抗感位点Pi37-1/pi37-1，Pi37-2/pi37-2，Pi37-3/pi37-3以及Pi37-4/pi37-4进行了比较分析。结果表明，Pi37-1和pi37-1在基因组、cDNA和氨基酸序列水平上都没有差异；Pi37-2和pi37-2在基因组、cDNA和氨基酸序列水平上均存在显著的序列差异；而Pi37-3和pi37-3在基因组、cDNA和氨基酸序列水平上仅存在少数氨基酸的差异；而Pi37-4和pi37-4在基因组水平上存在一个单碱基的突变，而反映在cDNA和氨基酸水平上则有一小段序列的缺失，说明该候选基因发生了移码突变。有趣的是，这4个候选基因是成簇存在于约60kb区域内的基因家族，彼此之间存在很高的序列同源性，特别是Pi37-3与Pi37-4之间的同源性达98％。 (3)候选基因的遗传互补分析 为了验证候选基因的功能，对上述获得的4个候选基因的阳性克隆，以高度感病品种Q1063作为受体，利用农杆菌介导的转化技术进行了遗传转化。然后，对获得的T0代转化植株进行了基于选择标记潮霉素基因片段的PCR分析、Southernblot分析，以及目的基因片段的PCR检测，并进行了初步的表型鉴定。结果表明，Pi37-3是Pi37的功能基因，为了进一步确认这一结果，对获得的T1代转化系也进行了接种鉴定，结果也同样证实Pi37-3是具有功能的基因。 (4)目的基因的结构及其功能分析 为了确定Pi37基因的结构特征及其功能，利用RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术，分别获得了抗感等位基因的全长cDNA，并进行了序列分析。结果表明，Pi37为具有NBS-LRR保守结构的抗病蛋白；其LRR区2个氨基酸的突变可能对抗性功能起决定性的作用。