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蛋白质磷酸化是一种研究广泛的翻译后修饰,其可逆变化是一种分子开关,可以影响蛋白质活性、调节蛋白质周转、调控蛋白质间相互作用关系、改变蛋白质构象、控制蛋白质亚细胞定位和与其它翻译后修饰相互作用,并进一步调控多种细胞过程,如增殖、分化和凋亡等。近年来定量磷酸化蛋白质组学快速发展,包括蛋白质相对或绝对定量分析方法、磷酸化肽段富集方法、色谱分级方法、质谱检测方法和相关生物信息学算法的开发等,使我们可以从整体水平对蛋白质磷酸化动态变化进行定量分析。在引言部分,我首先对这些常用技术进行总结。 棕色脂肪可以进行非颤抖性产热,以维持机体正常体温。从2009年通过PET-CT技术在成年人体中发现棕色脂肪以来,棕色脂肪来源和分化、白色脂肪棕色化、棕色/米色脂肪发热激活机制等相关的研究一直很火热。现在已经发现很多其它组织、调控因子等可以影响棕色/米色脂肪的发热激活,引言中对相关研究作了小结。冷刺激是一种激活棕色/米色脂肪发热的生理学方式,非常容易实现,近来是脂肪研究领域的研究热点。在论文主体部分,结合自己实验室组学平台优势,重点研究了急性和慢性冷刺激对脂肪组织的效应。 在研究棕色脂肪发热机制方面,现阶段的研究多集中于诱导线粒体解偶联蛋白UCP1和相关发热基因的表达,然而恒温动物的发热反应可以在几分钟内响应,提示该过程可能受其它机制所调控。在第一部分工作中,重点研究了各种脂肪急性冷刺激条件下的磷酸化蛋白质组动态变化。对C57BL6/J小鼠进行4℃冷刺激0、5、10和30min后,收取了棕色脂肪、皮下脂肪、肠系膜脂肪和附睾脂肪,进行了in vivo状态的磷酸化蛋白质组分析,进一步发现了不同部位脂肪组织磷酸化响应差异很大。通过激酶底物富集分析,发现了多个激酶与PKA共激活,而CLK和CK2则可能抑制PKA的激活。此外,磷酸化可以直接促进棕色脂肪的脂解过程和产热过程。脂包被蛋白PLIN5的155位丝氨酸和PLIN1的174位丝氨酸,和解偶联蛋白UCP1的87位丝氨酸,在冷刺激条件下可以被PKA迅速激活,磷酸化水平显著上调。 第二部分工作的研究重点是慢性冷刺激。在正常饮食和高腊饮食的小鼠进行16℃8周的冷适应后,通过分析棕色脂肪的蛋白质组和磷酸化蛋白质组变化,发现了对照组小鼠组学水平发生显著变化。蛋白质组数据显示蛋白质合成和氧化磷酸化相关的蛋白显著上调,而磷酸化组数据表明胰岛素信号通路和糖脂代谢相关的代谢通路被显著激活。相比较而言,高脂饮食干预的小鼠组学水平变化较小,提示高脂状态可能会减弱棕色脂肪对冷刺激的响应。另一发现值得关注,高脂小鼠中过氧化物酶体生物合成过程被显著激活。最后,我们重点分析了对照组UCP1-S87、PLIN1-S174和PLIN5-S155三个磷酸化位点及其蛋白质在慢性冷刺激过程中的变化趋势,发现UCP1的磷酸化和蛋白质丰度均上调,而PLIN的磷酸化和蛋白质受影响较小。 通过对脂肪组织急性和慢性冷刺激(慢性集中于棕色脂肪)的组学研究,我们对脂肪组织发热调控有了新的认识。此外,我们的差异磷酸化位点和蛋白质数据集可以为脂肪相关的研究提供参考。