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肿瘤转移是一个复杂而且有多步骤参与的过程。近年来研究表明：上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与上皮源性肿瘤转移过程密切相关,并且TGF-β1介导的信号通路在恶性肿瘤细胞EMT中发挥了十分重要的作用,如果能找到一种关键基因调控TGF-β1介导的信号通路,阻止EMT形成,将可能有效地控制恶性肿瘤的转移。我们前期研究发现：Caveolin-1在头颈鳞癌转移中发挥了重要作用。为了探讨Caveolin-1在头颈鳞癌细胞转移中的作用及其调控的分子机制,本课题首先制备了慢病毒介导的过表达和Caveolin-1干扰的重组慢病毒；利用Caveolin-1干扰慢病毒下调人头颈鳞癌细胞株Tu686中Caveolin-1的表达,通过体外实验观察它对细胞生长以及表型的影响；并通过活化TGF-β1信号通路后,分别上调、下调Caveolin-1的表达,对Caveolin-1调控TGF-β1信号通路在头颈鳞癌细胞EMT及侵袭转移的作用机制进行探讨,从而为头颈鳞癌转移发生的机制研究提供实验依据。本研究分为以下三部分：目的：构建Caveolin-1过表达和Caveolin-1干扰慢病毒载体方法：利用引物扩增Caveolin-1 cDNA和线上设计合成针对Caveolin-1靶基因的干扰序列shRNA;将二者分别与病毒载体连接,将载体转化大肠杆菌并鉴定阳性克隆,证实载体构建成功；利用慢病毒包装试剂盒将包含Caveolin-1过表达和干扰cDNA序列的病毒载体和包装载体共感染包装细胞,经回收、纯化得到Caveolin-1过表达和干扰的重组慢病毒。结果：测序结果证明：包含Caveolin-1cDNA过表达和干扰序列的慢病毒载体构建成功,得到Caveolin-1过表达和干扰重组慢病毒。目的：观察沉默Caveolin-1基因对头颈鳞癌细胞表型及生物学行为的影响方法：用慢病毒Caveolin-1 shRNA感染Tu686细胞,经筛选获得Caveolin-1基因沉默的稳转细胞；并用半定量PCR. Weatern-blot检测Caveolin-1 mRNA和蛋白表达变化；CCK8检测细胞生长增殖能力、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的情况；显微镜下观察细胞表型形态的变化；Western-blot检测细胞表型相关蛋白E-cadherin、Vimentin的变化；划痕愈合实验及Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力的变化。结果：慢病毒质粒干扰Tu686细胞后,证实重组慢病毒Caveolin-1 shRNA感染效率高达90%以上；筛选出Tu686Caveolin-1 RNAi+基因沉默细胞株和Tu686Caveolin-1 RNAi-阴性对照细胞株；CCK8和流式细胞仪检测发现实验组细胞的生长及凋亡情况与对照组细胞相比没有统计学差异(P>0.05)；显微镜下观察实验组细胞呈梭形,细胞有伪足伸出,细胞间隙增宽；Western-blot结果显示实验组细胞较阴性对照细胞上皮性标志物E-cadherin蛋白水平明显下调,间质性标志物Vimentin蛋白表达水平明显上调；划痕愈合实验显示实验组细胞较阴性对照细胞的迁移能力明显增强,24小时划痕愈合率分别为(55.50±5.6)%、(24.20±2.5)%(P<0.05);Transwell小室实验结果显示实验组细胞较阴性对照细胞的侵袭能力明显增强,48小时穿过基底膜细胞数分别为103±15、34±4(P<0.05)。目的：观察Caveolin-1对TGF-β1信号通路的调控作用及头颈鳞癌细胞侵袭迁移能力的影响方法：利用细胞免疫荧光技术在Tu686细胞中进行免疫细胞双染,检测TGF-βR I与Caveolin-1在细胞内定位情况；Western-blot检测沉默Caveolin-1基因实验组和阴性对照组细胞中TGF-β1下游蛋白分子Smad2和其磷酸化产物p-Smad2的表达的表达；TGF-β1刺激Tu686细胞48小后,利用Caveolin-1过表达慢病毒感染细胞,Western-blot检测Caveolin-1基因表达以及对TGF-β1信号通路下游蛋白表达的变化情况,Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。结果：细胞免疫荧光双染结果显示：TGF-β1受体TGF-βR I与Caveolin-1共定位于Tu686细胞膜上；沉默Caveolin-1基因实验组细胞中p-Smad2的表达较阴性对照组细胞明显上调(P<0.05),而总Smad2的表达并没有明显的变化(P>0.05)；随着TGF-β1剂量的增加,Tu686细胞Caveolin-1的表达逐渐下调(P<0.05),p-Smad2的表达则逐渐上调(P<0.05),而总的Smad2的表达没有明显变化(P>0.05);Caveolin-1过表达慢病毒Caveolin-1 cDNA感染TGF-β1活化Tu686细胞后,细胞中p-Smad2的表达显著下调(P<0.05),而总的Smad2的表达无明显变化(P>0.05),侵袭转移能力显著下降(P<0.05)。本研究得出如下结论：1. Caveolin-1对头颈鳞癌细胞生长增殖、细胞周期和凋亡没有明显的影响；2. Caveolin-1可以诱导头颈鳞癌细胞发生上皮-间质转化,并且可以明显增强头颈鳞癌细胞的侵袭和迁移能力；3.TGF-β1信号通路激活可诱导头颈鳞癌细胞发生上皮-间质转化,Caveolin-1通过调控TGF-β1信号通路在头颈鳞癌细胞上皮-间质转化以及侵袭转移中发挥了重要作用。