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[目的]巴戟天是著名的补肾要药,也是广东的道地药材,需种植5年才能采收。长期以来巴戟天的经济价值偏低,以至于道地产区德庆、高要等地种植面积逐步减少。为了开发出高水平的新药,显著提高巴戟天的经济价值,应当对巴戟天主要有效成分进行深入研究。老年痴呆症是影响人类健康的常见重大疾病之一,本课题组前期研究显示,巴戟天低聚糖中的主要有效成分巴戟甲素,具有抗老年痴呆症活性。为此,作者在完善巴戟甲素工业化制备工艺、巴戟天药材中巴戟甲素的定性和定量鉴别研究、巴戟甲素纯化工艺及质控体系的基础上,采用细胞和动物体内外实验结合法,观察巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型和Ap致SD大鼠拟痴呆模型的影响,阐明其抗老年痴呆药效及作用机制研究,为其抗老年痴呆新药研究与开发提供研究基础和科学依据。[方法]采用D-900离子交换树脂对巴戟天低聚糖进行静态和动态吸附试验,考察不同温度、不同树脂用量、不同流速和不同pH值等因素对吸附过程的影响,以脱色率和低聚糖保留率综合评价其脱色效果,优选巴戟天低聚糖最佳脱色工艺。而后采用不同浓度乙腈-水双相多次热回流提取法从低聚糖中分离纯化得到高纯度巴戟甲素原料药。采用薄层色谱法建立巴戟天中巴戟甲素定性鉴别方法;采用HPLC-ELSD法建立巴戟天中巴戟甲素定量检测方法。体外培养PC12细胞,采用MTT法检测巴戟甲素对正常PC12细胞的细胞毒性作用;采用A β25-35制备细胞损伤模型,应用MTT和LDH法检测细胞存活率、TUNEL试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用荧光分光光度计法检测细胞[Ca2+]i,线粒体膜电位、活性氧(ROS)等指标;采用试剂盒-酶标仪法测定细胞内SOD、MDA和GSH·Px等氧化指标;采用RT-PCR, Western-blot法检测Caspase-3、BAX、P21、E2F1、CDK4、 NF-κB、JAK2/STAT3等mRNA和蛋白的表达,观察活性成分对Aβ致PC12细胞损伤模型的影响,探讨巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型的保护作用及机制。实验利用硫代乙酰胆碱(ATCh)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱(Thiocholine),硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用,生成在412nm处有特征吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段,其吸光值即可代表起始反应速率这一原理,体外评价巴戟甲素的乙酰胆碱酯酶抑制能力。在体外乙酰胆碱酯酶抑制能力评价基础上,采用SD大鼠双侧海马区注射A β25-35各10μ g制备拟痴呆模型,下设巴戟甲素高、中、低剂量组和巴戟天组,同时设空白组、假手术组和阳性药组;连续灌胃给药25d后,采用Morris水迷宫进行行为学检测;采用试剂盒酶-标仪法测定脑组织中超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)等氧化指标,以及乙酰胆碱(Ach)和乙酰胆碱酯酶(TchE)以及Na+/K+-ATPase等含量;采用HPLC-ECD法检测脑组织中单胺类神经递质水平;采用HE染色法检测脑组织中海马椎体细胞和大脑皮质神经元细胞等相关指标,观察巴戟甲素对A β2535致SD大鼠拟痴呆模型的影响,揭示巴戟甲素抗老年痴呆药理学作用。[结果]脱色工艺研究表明D-900树脂吸附巴戟天低聚糖色素的最佳工艺参数为:采用动态吸附,柱溶液温度45℃,流速1.0Bv·h-1,上样液pH值6.0。取由脱色工艺得到巴戟天低聚糖,加5倍量80%乙腈热回流提取30min,趁热过滤,滤渣加5倍量55%乙腈热回流提取30min,趁热过滤,取滤液调乙腈至75%,冷藏24h析晶,取结晶重复以上步骤3次,即得纯度达95%的巴戟甲素原料药。巴戟天中巴戟甲素薄层鉴别方法:取巴戟天粗粉1.0g,80%丙酮热回流1.0h,滤过,滤渣加40%乙腈热回流0.5h,滤过,滤液即为供试品溶液。吸取样品溶液3μL点于硅胶G薄层板上,以正丁醇:无水乙醇:水:磷酸(3:2.6:2:0.3)、喷10%硫酸乙醇液,在105℃烘至斑点清晰。巴戟天中巴戟甲素定量检测方法:采用HPLC-ELSD法,Rezex RCM色谱柱(Phenomenex,300mm×7.8mm),流动相:超纯水,流速0.6mL· min-1;柱温:35℃;飘移管温度:100℃;载气:空气,流速2.0L·min-1;在此色谱条件下,巴戟甲素能达到很好的分离,无杂质峰干扰。MTT法检测结果显示:低剂量的巴戟甲素能促进细胞生长,且存在量效关系。巴戟甲素在100μ g·mL-1范围内,随着浓度的增加,细胞增殖加快,超过此浓度细胞生长开始被缓慢抑制,说明巴戟甲素具有一定的细胞毒性。MTT、LDH和流式细胞法检测结果显示A p25-35诱导PC12细胞的IC50为21.46μ mol· L-1,在该浓度下,细胞凋亡率、[Ca2+]i、线粒体膜电位、活性氧(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)等指标,以及Caspase-3、 BAX、P21、E2F1、CDK4、NF-κB、JAK2/STAT5等mRNA和蛋白的表达,与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.01),提示A β25-35对PC12细胞具有损伤作用。给予巴戟甲素与Aβ25-35处理后,其以上各项指标皆恢复到接近正常水平,提示在有效剂量范围内巴戟甲素具有保护A β25-35致PC12细胞损伤的作用,其作用机制与降低细胞内[Ca2+]i、升高线粒体膜电位、提高细胞抗氧化能力、抑制NF-κB和JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,同时激活P21的表达,抑制CDK4、E2F1等周期蛋白的表达等有关。巴戟甲素与乙酰胆碱酯酶抑制活性与反应时间具有相关性,反应前50min,随着时间延长,效果越好,反应50min后,保持一定抑制率,不再增大;巴戟甲素与乙酰胆碱酯酶抑制活性与药物浓度具有相关性,浓度越大,其抑制率越大。灌胃给予巴戟甲素25d后,水迷宫实验结果显示Aβ模型组定位航行潜伏期明显长于空白组,定位航行总路程明显高于空白组,而各给药组明显得到改善。空间探索实验结果显示空白组大鼠在第一象限(即平台原所在区域)游泳时间(27.36±3.38)s长于其他象限,差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,模型组在第一象限游泳时间(20.77±5.63)s明显较短,巴戟甲素高剂量组(31.93±3.39)s比空白组延长,差异具有统计学意义(P<0.01),其余各组差异没有统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,各给药组在第一象限游泳时间明显延长,且差异具有统计学意义(P<0.01)。实验结果提示Aβ具有神经毒性,可模拟老年痴呆长时记忆障碍特征;给予巴戟甲素治疗后,与模型组比较,大鼠定位航行潜伏期明显缩短,说明巴戟甲素具有改善老年痴呆模型大鼠记忆障碍。脏器系数测量结果显示,模型组脑、脾、肾、睾丸等脏器系数比空白组都降低,说明Aβ影响机体脏器功能,而给予巴戟甲素后,各脏器系数相应升高,说明巴戟甲素对老年痴呆大鼠各脏器具有补益作用。各给药剂量组动物脑内氧应激水平均得到一定的改善,与模型组比较,表现为大脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活力增加,MDA含量降低,其中高剂量组最明显,可显著增加GSH-Px活力,降低MDA含量(P<0.01),脑组织中Na+/K+-ATPase活性显著升高;单胺类神经递质水平显著升高;海马CA1区、大脑皮质和前脑基底核神经元凋亡抑制率明显降低。[结论]采用D-900离子交换树脂建立巴戟天低聚糖的脱色工艺具有显著的脱色效果,低聚糖保留率较高;再从低聚糖中采用不同浓度乙腈-水提取纯化得到巴戟甲素,其工艺稳定,操作简便,耗时比原来节省三分之二,可为大规模工业化制备工艺。实验所建立的薄层色谱法具有巴戟甲素特征斑点,HPLC-ELSD含量测定方法能定量检测巴戟天中巴戟甲素含量。实验从细胞水平和分子水平,研究探讨了巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型的保护作用及其机制,巴戟甲素具有抑制Aβ致PC12细胞凋亡的作用,其作用机制为巴戟甲素通过降低细胞内[Ca2+]i,直接或间接地抑制细胞损伤的发生;升高线粒体膜电位,提高细胞抗氧化能力,抑制NF-κB、JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,切断Caspase-3执行细胞凋亡级联反应的必经之路,发挥抗凋亡作用;同时激活P21的表达,抑制CDK4、E2F1等周期调控蛋白的表达,以纠正细胞周期的紊乱,使细胞得以正常分化,从而达到抑制细胞凋亡的作用。体外巴戟甲素抑制乙酰胆碱酯酶活性实验说明巴戟甲素具有一定的抑制乙酰胆碱酯酶活性,并呈现量效关系。实验采用β-淀粉样蛋白多肽25-35片段(Aβ25~35)(20μg)于大鼠双侧海马内一次性注射,诱发制备了拟痴呆动物模型。从行为学、氧化应激、胆碱能系统、能量代谢、神经递质和神经元凋亡等方面,观察了巴戟甲素对Aβ模型大鼠的影响,实验结果显示巴戟甲素可以改善Aβ致大鼠痴呆症状,其机制与提高抗氧化能力、激活脑能量代谢、改善胆碱能系统损伤和抑制大脑神经元凋亡等有关。本研究主要创新点1从细胞水平和分子水平,揭示了巴戟甲素通过降低细胞内[Ca2+]i,提高细胞抗氧化能力,抑制NF-κB、JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,同时激活P21抑制CDK4、 E2F1等周期调控蛋白的表达,达到抑制神经细胞凋亡的作用机制。2实验通过整体动物实验,揭示了巴戟甲素还可通过激活脑能量代谢、改善胆碱能系统损伤以达到防治老年痴呆症的目的。