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研究目的:晚期肺腺癌化疗主要以铂类为基础的联合方案治疗,但缺乏疗效预测基因。本课题组前期研究发现,线粒体融合基因2(mitofusin-2,MFN2)可通过MAPK信号传导通路调控细胞线粒体途径凋亡,与顺铂诱导肿瘤细胞凋亡有相同的信号传导通路,两者可能有协同性。因此,本研究拟从关注如下的关键问题以探索MFN2在肺癌中的功能及其在临床研究中的意义:(1)MFN2基因在肺腺癌患者体内的表达情况;(2)MFN2基因表达产物对肺腺癌细胞的存活、增殖和恶化有怎样的影响?(3)MFN2调控肺腺癌存活与增殖的机制是怎样的?研究方法:(1)我们首先利用30对人肺腺癌组织标本及癌旁正常组织样本,采用免疫组化实验比较癌与癌旁组织中MFN2蛋白的表达情况。(2)采用慢病毒介导的RNAi系统在肺腺癌细胞系中敲减MFN2,通过MTT实验、细胞周期检测、细胞凋亡和细胞侵袭实验分析MFN2对肺腺癌细胞增殖、存活及恶化的影响。(3)构建裸鼠成瘤动物模型分析MFN2基因敲减后肺腺癌的增殖情况。(4)基因表达芯片分析MFN2调控的下游基因,构建差异基因的调控网络,并通过Western Blot加以验证。(5)高通量筛选影响肺腺癌细胞增殖的MFN2下游靶基因。(6)对筛选得到的下游靶基因在肺腺癌和癌旁中的表达情况进行分析。(7)采用慢病毒介导的RNAi系统在肺腺癌细胞系中敲减下游靶基因,分析其对肺腺癌细胞增殖与存活的影响。研究结果:(1)免疫组织化学分析证实MFN2蛋白在人肺腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织。(2)慢病毒介导的RNAi系统可在人肺腺癌细胞株A549中有效抑制MFN2在RNA水平和蛋白水平的表达,细胞学实验提示,MFN2基因敲减后,A549细胞的增殖、细胞周期及细胞侵袭行为受到明显抑制。(3)裸鼠成瘤动物模型提示MFN2基因敲减后的A549细胞株成瘤能力下降,肿瘤生长较MFN2基因未敲减的A549细胞株生长缓慢。(4)基因芯片分析证实MFN2基因敲减后细胞周期相关通路受到抑制。芯片分析显示,诸如RAP1A、RALB及ITGA2等癌基因在MFN2基因表达下调后出现反向调节,该现象表明,MFN2基因在肿瘤发生发展中的机制具有双向调节性。(5)高通量筛选发现,MFN2基因的下游靶基因MLF1IP参与细胞增殖的调控。MLF1IP与PLK1相互作用是细胞周期和细胞分裂的关键步骤。(6)MLF1IP在肺腺癌样本中异常高表达。(7)慢病毒介导的RNAi系统抑制MLF1IP基因后可抑制A549细胞的增殖能力,且能干扰细胞周期并促进细胞的凋亡。研究结论:(1)MFN2基因是肺腺癌细胞增殖和存活的关键因子,MFN2基因沉默具有促进人肺腺癌细胞株凋亡的作用。(2)MFN2通过调控下游基因MLF1IP形成信号轴调控肺腺癌的存活与增殖。