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背景世界首例冷冻胚胎成功妊娠分娩报道于二十世纪八十年代,目前冷冻-复苏胚胎已经成为常见的辅助生殖衍生技术,配子以及原核期、卵裂期和囊胚期胚胎的有效冷冻保存方法也在不断的探索中。玻璃化冷冻(vitrification)技术的基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固,形成不规则的玻璃化样固体,保存了液态时正常分子和离子分布,因而在细胞内发生玻璃化时能起到保护作用,避免冰晶的产生对胚胎造成伤害。虽然玻璃化冷冻相比较慢速冷冻显著改善了人类配子和不同时期胚胎低温贮藏的复苏率、存活率和妊娠率,成为临床更可靠的冷冻方法,甚至被运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上,但仍不可避免的会发生冷冻损伤。冷冻损伤主要包括纺锤体和染色体异常,透明带变硬,细胞膜损害,超微结构损伤如线粒体异常等,以及其他可导致细胞死亡的改变,如DNA损伤,mRNA水平的改变和蛋白功能异常等,这些结构和功能的损伤常造成严重后果,但可能不会在解冻复苏时立即表现出来。端粒酶(telomerase)是由端粒RNA和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)两个亚基组成的核酸蛋白复合物。其中,TERT是端粒酶活性的必需和限速成分,其水平决定细胞端粒酶的活性。TERT能以自身RNA为模板反转录合成端粒DNA序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用。成熟体细胞的端粒酶活性缺乏或者极低,而在肿瘤细胞和生殖细胞中端粒酶活性较高,这种较高的活性可以保证细胞处于高度的活性状态。研究证明TERT对端粒长度的调节发生在转录水平上,人TERT沉默受表观遗传控制。端粒和端粒酶在动物生殖细胞受精和早期卵裂中发挥的重要作用。端粒酶缺陷模型小鼠的后代表现为进行性的组织器官增殖缺陷和生育力低下。目的分别测定成熟卵母细胞和原核期胚胎TERT mRNA表达量,对比玻璃化冷冻前后TERT mRNA表达水平的变化,初步探讨不同阶段卵子冷冻耐受性差异的原因,为人类卵子冷冻损伤机制和卵子库建立提供研究基础。材料和方法采用河南省动物中心8-12周昆明系小鼠,尿促性素(HMG)10IU/只后48小时注射人绒促性素(HCG)10IU/只,部分成熟卵子行体外受精(IVF)以获取原核期胚胎。实验组分为新鲜MII组,冻融MII组,新鲜合子组和冻融合子组。采用玻璃化冷冻保存MII卵子和原核期胚胎7-10天,分别PCR测定新鲜组和冷冻复苏组各种生殖细胞内TERT的mRNA表达水平,进行3次独立重复实验,采用SPSS12.0统计学软件对数据进行统计学分析,并行TERT抗体荧光染色。结果1.小鼠新鲜MII卵和原核期胚胎荧光免疫染色均见TERT蛋白胞浆阳性表达。获得新鲜MII卵157枚,原核期胚胎133枚,原核期胚胎TERT含量略低于MII期卵母细胞,但无统计学差异(P>0.05)。2.获得冻融MII卵118枚(复苏存活率71.5%),其TERT含量略低于新鲜MII期卵母细胞,但无统计学差异(P>0.05)。3.获得冻融原核期胚胎121枚(复苏存活率87.7%),其TERT含量略低于新鲜原核期胚胎,但无统计学差异(P＞0.05)。结论1.小鼠成熟卵母细胞和原核期胚胎均表达端粒酶活性。2.原核期胚胎端粒酶活性稍低于成熟卵母细胞,但无显著性差异。3.玻璃化冷冻后,小鼠成熟卵母细胞和原核期胚胎端粒酶活性均有降低趋势,但无显著性差异。4.玻璃化冷冻复苏可能不影响小鼠成熟卵母细胞和原核期胚胎端粒酶活性的mRNA水平表达。