弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)中最常见的一种亚型,约占30-40%。DLBCL是一组在组织形态学、分子生物学、细胞遗传学及临床预后方面均存在很大的异质性的侵袭性恶性肿瘤。近几年来,联合化疗及利妥昔单抗等生物靶向治疗使DLBCL患者的治疗效果显著提高、生存期明显延长,但仍有部分患者复发、耐药并最终死亡。研究表明,很多病理类型的淋巴瘤的发生发展均与多个因子异常表达、多个信号通路异常激活有关,因此进一步深入研究DLBCL特异性分子标志物和信号传导通路、探讨DLBCL的发病机制、寻找更有效的靶向治疗手段成为亟待解决的问题。Metadherin (MTDH,亦名为astrocyte elevated gene-1/AEG-1或Lyric)是近几年在人胚胎初级星形胶质细胞(primary human fetal astrocytes-PHFAs)中首次克隆出来的新基因,可在人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)感染或病毒糖蛋白gp120或肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)处理后诱导产生。人类MTDH基因位于染色体8q22.1,由12个外显子和11个内含子组成,MTDH mRNA全长为7667bp,编码的蛋白由582个氨基酸组成,分子量为64kDa,等电点为9.33。近年来随着对MTDH的研究进一步深入,发现MTDH与肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为有关,是促进肿瘤发生发展的关键因子。MTDH在多种肿瘤的细胞系和肿瘤组织中高表达,如黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝细胞肝癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤等。MTDH高表达可以促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移,MTDH基因沉默可以显著抑制肿瘤细胞的克隆形成和侵袭、促进肿瘤细胞凋亡。MTDH通过调控多个与肿瘤发生发展有关的信号传导通路来促进肿瘤进展,如NF-κB、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路不仅在动物的胚胎发育及维持组织、器官的稳定性的过程中发挥着重要作用,而且研究表明,其异常激活与包括恶性肿瘤在内的多种疾病的发病有关。Wnt/β-catenin信号通路参与多种亚型的非霍奇金淋巴瘤的发生发展,如Epstein-Barr (EB)病毒阳性的Burkitt’s淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、结外边缘区淋巴瘤和DLBCL等。因此,对Wnt/β-catenin途径的激活状态和调控的进一步研究可增进对DLBCL发病机制的认识。在肝细胞肝癌中,MTDH通过激活Ras途径的Raf/MEK/MAPK分支作用于Wnt/β-catenin途径,导致β-catenin向核内移位,进而上调靶基因的表达。有关胃癌的研究表明,特异性小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)介导的MTDH基因沉默可明显降低胃癌细胞β-catenin的表达,因此MTDH在Wnt/β-catenin通路相关的胃癌中同样起着重要作用。MTDH和Wnt/β-catenin信号通路均与肿瘤的发病有关,而且二者在肝细胞肝细胞肝癌和胃癌中存在紧密联系,但MTDH在DLBCL中的表达情况及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系尚不清楚。本研究应用细胞生物学、分子生物学、免疫学及基因沉默等技术,阐明了MTDH和Wnt/β-catenin信号通路在DLBCL中的表达情况及二者的关系,探讨了MTDH在DLBCL生长中的作用及机制,为寻求DLBCL的新的分子标志物和有效的生物靶向治疗方法提供理论依据。第一部分弥漫大B细胞淋巴瘤与反应性增生组织人类基因差异表达的研究目的：弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常见的一种类型,约占30-40%。DLBCL是一组在组织形态学、分子生物学、细胞遗传学及临床预后方面均存在很大的异质性的侵袭性恶性肿瘤。近几年来,联合化疗及利妥昔单抗等生物靶向治疗使DLBCL患者的治疗效果显著提高、生存期明显延长,但仍有部分患者复发、耐药并最终死亡。DLBCL的发生发展是一个多因素参与的复杂过程,目前虽然做了大量研究,其病因及发病机制仍不清楚。本研究应用双频35k人类基因组寡核苷酸芯片技术,筛选比较了弥漫大B细胞淋巴瘤与淋巴结反应性增生组织的差异表达基因,并进行了Pathway分析,探讨了部分差异表达基因与DLBCL发生发展的关系。材料与方法：1.标本收集2.人类基因组寡核苷酸芯片(35K)a淋巴结组织总RNA的提取b对样品RNA进行荧光标记c杂交与清洗d芯片扫描e芯片图像的采集与数据分析结果：(1)经过对弥漫大B细胞淋巴瘤与反应性增生标本基因表达谱的比较,筛选出两组间差异表达的基因(Ratio≥2或≤0.5,其中芯片1包含上调基因共955个、下调基因共1019个,芯片2包含上调基因共587个、下调基因共1318个)。(2)对差异表达基因进行KEGG、BioCarta和GenMAPP Pathway分析,显示这些基因涉及到信号传导相关基因、癌基因和原癌基因、免疫缺陷与免疫调节相关基因、肿瘤相关基因、凋亡相关基因、细胞因子受体相关基因、代谢相关基因、细胞周期相关基因、结合蛋白相关基因、蛋白酶体相关基因、细胞毒性相关基因、补体和凝血途径相关基因、抗原加工与递呈相关基因、细胞粘附分子相关基因等。很多基因虽然发挥不同的生物学功能,但它们之间存在着错综复杂的联系,形成复杂的网络,共同参与各项生命活动及疾病过程的调控。(3) MTDH及部分Wnt/β-catenin信号通路相关基因如LEF1、CCND2、CCND1等表达上调。结论：(1) DLBCL是一组在组织形态学、分子生物学、细胞遗传学及临床预后方面均存在很大的异质性的侵袭性恶性肿瘤,其发生发展涉及多基因、多因素的参与。(2)本研究应用35k人类基因组寡核苷酸芯片技术,对弥漫大B细胞淋巴瘤与反应性增生淋巴结组织进行了差异表达基因的筛选和分析,发现了多个参与不同细胞活动、发挥不同功能的基因。这些基因可能在DLBCL的发生发展中起着重要作用。(3) MTDH和Wnt/p-catenin信号通路可能与DLBCL的发病有关。第二部分MTDH、Wnt/β-catenin信号通路在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义目的：MTDH是近几年克隆出来的新基因。研究表明,MTDH与肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为有关,是促进肿瘤发生发展的关键因子。MTDH通过调控多个与肿瘤发生发展有关的信号传导通路来促进肿瘤进展,如NF-κB、 PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路。其中,Wnt/β-catenin信号通路参与多种非霍奇金淋巴瘤的发生发展,β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键因子,在激活状态下,β-catenin在胞浆内积累,并进入核内,激活下游靶基因的表达。为了研究MTDH、Wnt/β-catenin信号通路在DLBCL中的表达情况,我们收集病理诊断明确的DLBCL和反应性增生淋巴结组织,对MTDH以及Wnt/β-catenin信号通路的关键因子β-catenin在两组组织中的mRNA和蛋白表达情况进行检测,并与患者的临床特征进行相关性分析,探讨它们在DLBCL发生发展过程中的作用,为寻求针对DLBCL的新的生物靶向治疗方法提供理论依据。材料与方法：1.标本收集2.提取RNA,进行实时定量RT-PCR3.蛋白提取与蛋白印迹分析4.免疫组织化学5.统计学分析结果：1. MTDH、β-catenin在DLBCL组织中均高表达。无论是mRNA水平还是蛋白水平,MTDH、β-catenin在DLBCL组织中的表达均高于淋巴结反应性增生组(P<0.0001)。免疫组织化学(Immunohisto-chemistry, IHC)结果显示：76.67%(23/30例)标本MTDH为阳性表达,46.67%(14/30例)标本存在β-catenin的核内表达,而反应性增生淋巴结组织中未发现β-catenin的核内聚集。2. MTDH高表达和P-catenin核内表达与DLBCL临床分期呈正相关(IHC)。我们对30例DLBCL患者的临床资料进行统计学分析,研究MTDH及β-catenin表达与临床特征的关系。结果显示,MTDH高表达和β-catenin核内表达与DLBCL患者的年龄(P=0.204,P=1.000)、性别(P=1.000,P=0.466)及有无B症状(P=1.000,P=0.713)均无相关性,而与其临床分期呈正相关(r=0.507,P<0.05；r=0.788,P<0.05)。结论：1.本研究通过实时定量RT-PCR、Western Blot等技术的检测,发现MTDH、 β-catenin在DLBCL组织中均高表达。2.IHC结果显示：在46.67%(14/30例)DLBCL患者的肿瘤组织中存在P-catenin的核内表达,表明Wnt/β-catenin信号通路在DLBCL中可能处于激活状态。3. MTDH高表达和β-catenin核内表达均与DLBCL患者的临床分期呈正相关。4. MTDH和β-catenin可能共同参与了DLBCL的发生发展。第三部分MTDH表达变化对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞生物学行为的影响及其机制研究目的：MTDH与肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为有关,是促进肿瘤发生发展的关键因子。MTDH在体外培养的多种恶性肿瘤的细胞系中高表达,并通过调控多个与肿瘤发生发展有关的信号传导通路来促进肿瘤进展。本研究应用人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株LY1和LY8为研究对象,首先检测MTDH、p-catenin在DLBCL细胞株中的表达情况,并分别应用TNF-a诱导MTDH高表达和慢病毒介导的MTDH基因沉默,进一步研究MTDH表达变化对DLBCL细胞株生物学行为的影响及MTDH与Wnt/β-catenin信号通路在DLBCL中的调控关系。材料与方法：1.标本收集2.细胞培养3.慢病毒载体介导的RNAi靶向沉默弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的MTDH基因4.流式细胞术检测细胞转染率5.提取RNA,进行实时定量RT-PCR6.分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)7.蛋白提取及蛋白印迹分析8.流式细胞术检测细胞凋亡9.3H掺入法检测细胞增殖10.统计学分析结果：1.相比较正常人PBMCs, DLBCL细胞株中MTDH和β-catenin均高表达,且核蛋白的Western Blot分析显示,DLBCL细胞株中存在β-catenin的核内表达。2. TNF-α诱导MTDH高表达后,DLBCL细胞增殖增加(LY1:5500±630.2v.15393±1603C.P.M, n=3, P<0.05; LY8:12067±1313v.24943±3938, n=3, P<0.05),细胞凋亡受抑(LY1:23.83±1.762v.16.20±0.9849%, n=3, P<0.05; LY8:14.23±0.3512v.8.63±0.7496%, n=3, P<0.05).3. TNF-α诱导MTDH高表达后,β-catenin在DLBCL细胞中的总蛋白及胞核蛋白表达水平升高(P<0.05)。4.慢病毒载体介导的MTDH RNAi可以通过转录后机制抑制DLBCL细胞中的MTDH基因的表达。5.慢病毒载体介导的MTDH基因沉默可以促进DLBCL细胞株LY8凋亡(13.11±6.744v.23.43±6.361%,n=3,P<0.05)。6.慢病毒载体介导MTDH基因沉默使DLBCL细胞株LY8中β-catenin(?)总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白的表达水平均降低(P<0.05)。结论：1. MTDH和β-catenin在DLBCL细胞株中均高表达,且存在β-catenin的核内表达现象。2. MTDH高表达可以促进DLBCL细胞增殖,并抑制其凋亡。3. MTDH基因沉默可以促进DLBCL细胞凋亡。4. MTDH能够促进β-catenin向核内移位,进一步激活Wnt/β-catenin信号通路。5. MTDH可能与DLBCL的发生发展密切相关,而且这种作用可能是通过Wnt/β-catenin信号通路介导的。