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松材线虫病又称为松树萎蔫病(Pine wilt disease)，是以松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)为主要病原的病害系统，是林业上最为严重的生物灾害之一。松材线虫在侵染到松树以后，短时间内的繁殖速度非常快，能够引起寄主松树的防御反应，使松树代谢产生出大量的蒎烯类物质，这类物质汽化后进入木质部的管胞中，使木质部出现较多的空洞，最终导致松树因水分输导受阻而枯死。蒎烯类化合物作为松树防御松材线虫的主要物质，在寄主防御松材线虫入侵的过程中起到了关键的作用。松材线虫在松树上完成侵染、繁殖、迁移和致病的整个过程中，与松树蒎烯类物质的代谢可能存在互作关系。因此本研究选择松树代谢的化合物中所占比重最大的α-蒎烯，通过离体培养的方式来研究松材线虫在两种α-蒎烯浓度(56.33mg/ml、214.5mg/m1)胁迫条件下的种群数量、种群结构和雌雄比的变化规律，旨在寻求松材线虫应对α-蒎烯胁迫下的繁殖对策。通过对丽种α-蒎烯浓度处理松材线虫的转录组数据进行分析，筛选出与松材线虫繁殖相关的功能基因，然后克隆出响应α-蒎烯胁迫且与繁殖相关的BX-clec和BX-F58基因，并对两条目的基因进行RNA干扰，旨在阐释α-蒎烯胁迫条件下松材线虫在生理和分子水平上的响应机制，从而为松材线虫的致病机理和繁殖规律等研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下:
1)建立松材线虫3♀:1(♀)的交配体系，研究其种群数量、种群结构和种群雌雄比的变化规律。实验结果表明，松材线虫的种群数量在接种PDA培养后有明显的增长趋势，接种第10天(d)种群的数量达到最大，从接种第11d起种群数量开始下降。在接种7d内其种群数量和雌雄比增长的速度最快，而接种7d后种群中雄虫的数量开始增多，种群的雌雄比开始下降，是由于此时PDA平板中的菌丝被松材线虫完全取食，松材线虫因缺乏食物而处于不利的环境中所导致。在整个培养阶段幼虫所占种群的比例最大，幼虫数量与种群数量的最大值均出现在接种后第10d且两者变化规律也较为一致，说明松材线虫种群中的幼虫数量与种群总数量成正相关。根据种群数量的变化规律，选出松材线虫7个关键的繁殖时间点分别为:4天、6天、7天、9天、10天、11天、12天，为下一步实验奠定基础。2)高浓度α-蒎烯(214.5mg/m1)处理下松材线虫的种群数量和雌雄比均高于对照组和低浓度α-蒎烯(56.33mg/m1)处理。松材线虫在高浓度α-蒎烯处理下能够产生更多的雌性线虫并且调节种群结构(种群中幼虫和卯的比例相对稳定);而在低浓度α-蒎烯处理下则产生更多的雄性线虫并且调节种群结构(种群中幼虫和卵的比例开始降低)。研究结果表明，松材线虫在。α-蒎烯肋、迫下是通过调节种群雌雄比和种群结构来维持种群发展的繁殖对策。
3)通过对转录组数据的分析，筛选出两个响应α-蒎烯胁迫且与繁殖相关的特异表达基因，分别为:BUX.s00713.777(BX-clec);BUX.s01254.227(BX-F58)。松材线虫全基因组网站中的功能注释显示，两个基因与松材线虫的繁殖、生殖系统发育、幼虫生长发育、胚胎发育和卵的孵化等生物学过程相关。克隆出两个基因以后与松材线虫全基因组网站上的CDS序列进行比对，其同源性均为100％，其中BX-clec基因长度为543bp、BX-F58基因为486bp。通过在NCBI上比对发现，BX-clec基因与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)clec-1，基因的同源性为55％，属于CLECT家族类基因;BX-F58基因与秀丽隐杆线虫(C.elegans)F58F12.1，基因的同源性为70％，属于F1-ATPase-delta家族类基因。两个目的基因均只有一个蛋白结构域且基因编码的蛋白稳定性较高，基因行使的功能相对保守。实时定量PCR的检测结果表明，高、低浓度d。蒎处理条件下BX-clec和BX-F58基因均能响应α-蒎烯的胁迫且表达量存在明显的差异。
4)通过构建BX-c彪c、BX-F58及阴性对照GFP基因的RNAi载体，体外成功合成dsRNA后分别浸泡处理松材线虫。实时定量PCR的检测结果表明，RNAi后BX-clec和BX-F58基因在两种α-蒎烯浓度处理条件下均被干扰成功，尤其在低浓度α-蒎烯处理下BX-clec和BX-F58基因的表达量下降最明显，分别为73％和46％。高浓度α-蒎烯处理下，两个基因干扰组的种群数量均低于对照组。低浓度旺.蒎烯处理下，BX-clec基因干扰组幼虫的比例从接种第7d起开始高于对照组:BX-F58基因干扰组和对照组幼虫的比例变化规律则不明显。高浓度α-蒎烯处理下，BX-celec基因干扰组幼虫的比例从第7d起开始低于对照组，而BX-F58举因干扰组幼虫的比例从接种第10d起开始低于对照组。高浓度α-蒎烯处理下，两个基因干扰组的雌雄比均低于对照组;低浓度α-蒎烯处理下，干扰组和对照组的雌雄比变化规律则不明显。高浓度α-蒎烯处理下，当BX-clec和BX-F58基因受到下扰以后，种群中幼虫的比例和种群的雌雄比均开始下降且低于对!暇组，进而促使种群数量下降。研究结果说明，BX-clec和BX-F58两个基因参与了松材线虫应对α-蒎烯胁迫的过程，并且调节了松材线虫在α-蒎烯胁迫下的种群数量、种群结构和种群雌雄比的变化。
综上所述，松材线虫在高、低两种α-蒎烯浓度胁迫下，采用了不同的繁殖对策来维持种群发展。两个目的基因参与调控了松材线虫在α-蒎烯胁迫下的繁殖对策，从而影响松材线虫种群数量的变化，是松材线虫在侵染松树过程中较为关键的繁殖相关基因之一。
1)建立松材线虫3♀:1(♀)的交配体系，研究其种群数量、种群结构和种群雌雄比的变化规律。实验结果表明，松材线虫的种群数量在接种PDA培养后有明显的增长趋势，接种第10天(d)种群的数量达到最大，从接种第11d起种群数量开始下降。在接种7d内其种群数量和雌雄比增长的速度最快，而接种7d后种群中雄虫的数量开始增多，种群的雌雄比开始下降，是由于此时PDA平板中的菌丝被松材线虫完全取食，松材线虫因缺乏食物而处于不利的环境中所导致。在整个培养阶段幼虫所占种群的比例最大，幼虫数量与种群数量的最大值均出现在接种后第10d且两者变化规律也较为一致，说明松材线虫种群中的幼虫数量与种群总数量成正相关。根据种群数量的变化规律，选出松材线虫7个关键的繁殖时间点分别为:4天、6天、7天、9天、10天、11天、12天，为下一步实验奠定基础。2)高浓度α-蒎烯(214.5mg/m1)处理下松材线虫的种群数量和雌雄比均高于对照组和低浓度α-蒎烯(56.33mg/m1)处理。松材线虫在高浓度α-蒎烯处理下能够产生更多的雌性线虫并且调节种群结构(种群中幼虫和卯的比例相对稳定);而在低浓度α-蒎烯处理下则产生更多的雄性线虫并且调节种群结构(种群中幼虫和卵的比例开始降低)。研究结果表明，松材线虫在。α-蒎烯肋、迫下是通过调节种群雌雄比和种群结构来维持种群发展的繁殖对策。
3)通过对转录组数据的分析，筛选出两个响应α-蒎烯胁迫且与繁殖相关的特异表达基因，分别为:BUX.s00713.777(BX-clec);BUX.s01254.227(BX-F58)。松材线虫全基因组网站中的功能注释显示，两个基因与松材线虫的繁殖、生殖系统发育、幼虫生长发育、胚胎发育和卵的孵化等生物学过程相关。克隆出两个基因以后与松材线虫全基因组网站上的CDS序列进行比对，其同源性均为100％，其中BX-clec基因长度为543bp、BX-F58基因为486bp。通过在NCBI上比对发现，BX-clec基因与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)clec-1，基因的同源性为55％，属于CLECT家族类基因;BX-F58基因与秀丽隐杆线虫(C.elegans)F58F12.1，基因的同源性为70％，属于F1-ATPase-delta家族类基因。两个目的基因均只有一个蛋白结构域且基因编码的蛋白稳定性较高，基因行使的功能相对保守。实时定量PCR的检测结果表明，高、低浓度d。蒎处理条件下BX-clec和BX-F58基因均能响应α-蒎烯的胁迫且表达量存在明显的差异。
4)通过构建BX-c彪c、BX-F58及阴性对照GFP基因的RNAi载体，体外成功合成dsRNA后分别浸泡处理松材线虫。实时定量PCR的检测结果表明，RNAi后BX-clec和BX-F58基因在两种α-蒎烯浓度处理条件下均被干扰成功，尤其在低浓度α-蒎烯处理下BX-clec和BX-F58基因的表达量下降最明显，分别为73％和46％。高浓度α-蒎烯处理下，两个基因干扰组的种群数量均低于对照组。低浓度旺.蒎烯处理下，BX-clec基因干扰组幼虫的比例从接种第7d起开始高于对照组:BX-F58基因干扰组和对照组幼虫的比例变化规律则不明显。高浓度α-蒎烯处理下，BX-celec基因干扰组幼虫的比例从第7d起开始低于对照组，而BX-F58举因干扰组幼虫的比例从接种第10d起开始低于对照组。高浓度α-蒎烯处理下，两个基因干扰组的雌雄比均低于对照组;低浓度α-蒎烯处理下，干扰组和对照组的雌雄比变化规律则不明显。高浓度α-蒎烯处理下，当BX-clec和BX-F58基因受到下扰以后，种群中幼虫的比例和种群的雌雄比均开始下降且低于对!暇组，进而促使种群数量下降。研究结果说明，BX-clec和BX-F58两个基因参与了松材线虫应对α-蒎烯胁迫的过程，并且调节了松材线虫在α-蒎烯胁迫下的种群数量、种群结构和种群雌雄比的变化。
综上所述，松材线虫在高、低两种α-蒎烯浓度胁迫下，采用了不同的繁殖对策来维持种群发展。两个目的基因参与调控了松材线虫在α-蒎烯胁迫下的繁殖对策，从而影响松材线虫种群数量的变化，是松材线虫在侵染松树过程中较为关键的繁殖相关基因之一。