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背景：食管癌是损害人类健康的主要恶性肿瘤之一，侵袭性高。在世界范围内，发病率在全部肿瘤中为第8，在肿瘤关联死亡中位于第6。我国是食管癌高发病区，每年的新发病人数占全世界的一半以上。食管癌患者预后差，5年生存率为5%-45%。放射治疗是食管癌治疗的重要手段之一。然而，影响放疗效果的因素很多，组织缺氧程度、谷胱甘肽含量、肿瘤对辐射效应存在个体差异等均导致放疗效果不如意，甚至出现严重的放疗抵抗性。放射抵抗是食管癌治疗失败的重要原因。因此，研究放疗抵抗的发生机制，有助于为食管癌的治疗及预后评估提供新的靶点和策略，这是目前食管癌综合治疗中亟待解决的热点问题。MicroRNAs（miRNA）是内源性非编码的单链小RNAs分子，长度约18-25个核苷酸。文献报道射线可以引起组织或细胞的miRNA表达谱发生变化，诱发肿瘤放疗抵抗性的发生，但目前关于miRNA作用于肿瘤放疗抵抗性的具体机制尚不透彻。我们的研究发现miR-205在食管鳞状细胞癌中高表达，而它与食管癌放疗的关系国内外目前尚未有报道。在实验的前期，我们建立了三株食管癌细胞的放疗抵抗株，对比miR-205在放疗抵抗株与亲本株中的表达水平，结果显示miR-205在三株放疗抵抗株中的表达水平均显著上调，提示miR-205参与了食管癌放疗抵抗性的调控。因此我们从细胞、分子、体内实验方面探讨miR-205对食管癌的放疗抵抗性作用与分子机制。目的：1、建立食管癌放疗抵抗株，并检验其与亲本株的分子差异；2、体内外实验研究miR-205对食管癌的放疗抵抗性作用；3、探讨miR-205对食管癌放疗抵抗性的分子机制；方法：1、分割剂量法构建食管癌放疗抵抗株；克隆形成实验检验放疗抵制株与亲本株的放疗抵抗性；流式细胞仪分析放疗抵制株与亲本株辐射下的凋亡率；Western Blot实验检测放疗抵制株与亲本株的分子差异。2、Taqman qPCR检测抵抗株与亲本株miR-205的表达差异，同时检测辐射后早期不同时间点miR-205的变化；细胞克隆形成实验检验过表达miR-205或干扰miR-205对食管癌细胞放疗抵抗性的影响；流式细胞仪分析过表达miR-205或干扰miR-205对食管癌细胞辐射下凋亡与周期的影响。3、Taqman qPCR和SYBR qPCR分别检测细胞辐射后不同时间点miR-205和miR-205HG的表达；生物信息学预测SP1是调控miR-205表达的转录因子；TaqmanqPCR和SYBR qPCR分别检测干扰SP1后的SP1和miR-205表达；构建双荧光素酶报告基因质粒，并检测SP1作用于miR-205HG启动区的荧光素酶活性； ChIP普通PCR和ChIP qPCR检测SP1与miR-205HG启动区的结合情况。4、生物信息学预测PTEN可能是miR-205的直接靶点，并用双荧光报告基因实验和Western Blot进行验证；流式细胞仪检测PTEN与miR-205相互作用对食管癌细胞辐射下的凋亡影响；Western Blot检验miR-205表达变化对Akt通路的影响。5、流式细胞仪分选细胞；Taqman qPCR检测miR-205的干扰效果；体内实验验证miR-205促进食管癌放疗抵抗性；HE染色检测瘤块的坏死程度。结果：1、建立食管癌放疗抵抗株，检测其与亲本株的差异抵制株细胞多呈梭状或纺锤状，有上皮间质转变趋势。放疗抵制株细胞辐射下的克隆形成能力强于亲本株细胞。放疗抵抗株细胞辐射下的凋亡率低于亲本株。放疗抵抗株细胞的Akt信号通路被激活。2、MiR-205促进食管癌细胞的放疗抵抗性食管癌放疗抵抗株中的miR-205表达上调，且辐射早期即可诱导食管癌细胞miR-205的表达增加。上调miR-205增强食管癌细胞辐射下的克隆形成能力，抑制食管癌细胞辐射下的凋亡，但对辐射下食管癌细胞的周期无影响。下调miR-205抑制食管癌细胞辐射下的克隆形成能力，增强辐射下食管癌细胞的凋亡，对辐射下食管癌细胞的周期亦无影响。3、SP1诱导miR-205表达调控食管癌放疗抵抗的分子机制食管癌细胞miR-205HG的转录本在辐射后不同时间点随着miR-205的上调而增加，miR-205HG与miR-205的表达水平正相关，证实miR-205HG是miR-205的转录前体。生物信息学预测miR-205HG的启动子区有转录因子SP1的结合位点，提示SP1可能是调控miR-205表达的转录因子。下调SP1表达后，miR-205的表达也下调，且能逆转X射线辐照诱导的miR-205表达上调。X射线辐照和过表达SP1均能增加miR-205HG启动区荧光素酶报告基因的活性，而下调SP1能抑制X射线辐照诱导的miR-205HG转录活性增加，证实X射线辐照是通过促进SP1对miR-205HG的转录激活来增加miR-205的表达。ChIP实验证实X射线辐照能够促进SP1与miR-205HG启动区的结合。4、MiR-205调控PTEN，激活Akt通路，诱导放疗抵抗的分子机制生物信息学预测显示PTEN是miR-205作用的下游靶点，双荧光素酶报告基因活性检测表明miR-205可以显著抑制野生型PTEN3’UTR报告基因活性，但不能抑制突变型PTEN3’UTR报告基因活性。Western Blot证实过表达miR-205或干扰miR-205可以下调或上调PTEN的蛋白表达。PTEN可以部分逆转miR-205对食管癌细胞辐射下的凋亡抑制作用。过表达亲本株细胞中的miR-205显著激活了Akt信号通路，干扰放疗抵抗株细胞的miR-205表达，显著抑制了Akt信号通路。5、MiR-205促进食管癌放疗抵抗性的体内实验细胞分选并检测后得到稳定干扰miR-205的稳转细胞株。抑制miR-205的表达能减弱食管癌的放疗抵抗性。HE染色显示辐射能诱导肿瘤坏死，抑制miR-205的表达能促进辐射诱导的肿瘤坏死发生。结论：X射线辐照后能通过激活转录因子SP1，促进SP1对miR-205HG的转录激活，进而增加miR-205的表达水平；miR-205能通过抑制食管癌细胞凋亡诱导食管癌细胞的放疗抵抗；并且，我们证实PTEN是miR-205调控食管癌放疗抵抗性的下游直接靶基因，miR-205通过抑制PTEN表达，激活Akt通路来实现对食管癌细胞放疗抵抗的调控。