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本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分：外周血中循环内皮祖细胞数目与非小细胞肺癌疾病分期的关系 目的：收集临床患者外周血标本，探讨外周血中内皮祖细胞数目与非小细胞肺癌疾病分期的相关性。 方法：采集健康人群、非小细胞肺癌初诊患者的外周血标本，并收集相关临床资料，通过梯度离心法分离单个核细胞层、流式抗体标记内皮祖细胞表面抗原(CD34/CD133/CD309)、流式细胞学检测各标本中循环内皮祖细胞数目，验证外周血中内皮祖细胞数目与非小细胞肺癌疾病分期的关联。 结果：收集24例初诊NSCLC患者和5例健康志愿者外周血，分离单个核细胞层，选取流式抗体标记干细胞表面分子CD34、CD133及成熟内皮细胞表面分子CD309，通过流式细胞术检测外周血标本中CD34+CD33+CD309+三阳性细胞群。 结果显示，外周血中内皮祖细胞平均值在健康对照组中最低（19.2±10.9个/600000单个核细胞）；在非小细胞肺癌患者中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者内皮祖细胞平均值依次为60.3±11.5、130.0±32.3及219.9±142.4，外周血中循环内皮祖细胞数目随肺癌分期依次递增。统计学分析进一步提示健康人群与IV期肺癌患者、Ⅱ期肺癌患者与Ⅳ期肺癌患者间的内皮祖细胞数具有显著差异。 结论：非小细胞肺癌患者外周血中循环内皮祖细胞数目较健康对照显著增多；非小细胞肺癌患者中，外周血循环内皮祖细胞数目与肺癌分期呈正相关。 第二部分：内皮祖细胞通过HDAC7调节非小细胞肺癌的血管新生 目的：从体内外水平探讨HDAC7通过调节内皮祖细胞的结构性功能和非结构性功能发挥促肺癌血管新生作用。 方法：分离、培养和鉴定人脐血来源的内皮祖细胞，并通过慢病毒载体构建HDAC7表达敲低的内皮祖细胞。在细胞水平，通过体外小管形成实验、Western blot技术，比较HDAC7敲低前后内皮祖细胞的成管能力以及其产生的关键促成管因子VEGF的表达变化。在组织水平，通过免疫组化和免疫荧光验证肿瘤内新生微血管密度变化以及内皮祖细胞嵌入新生血管的情况；在动物水平，通过向非小细胞肺癌裸鼠移植瘤模型回输正常内皮祖细胞、HDAC7敲低后内皮祖细胞，检测HDAC7敲低后的内皮祖细胞对移植瘤生长情况的影响，并应用活体成像、彩色多普勒超声及在体共聚焦激光显微内镜观察肿瘤组织局部的内皮祖细胞招募、血流灌注及微血管结构的变化。 结果：采集健康产妇脐血，分离、提取、培养原代细胞，从形态学、功能学、细胞表型成功鉴定原代内皮祖细胞。构建慢病毒载体敲低内皮祖细胞中HDAC7的表达，并验证敲低方法的有效性。细胞水平上，HDAC7敲低后的内皮祖细胞，其单位成管个数及单位成管面积显著减少，伴随VEGF表达显著减少。组织水平上，敲低HDAC7抑制内皮祖细胞嵌入管腔结构，导致肿瘤组织内管壁结构不完整，新生血管数减少。在肺癌移植瘤模型中，敲低HDAC7可抑制内皮祖细胞在肿瘤局部的募集，导致其构建密闭血管腔的能力减弱，单位毛细血管面积及有效血流灌注量减少，最终表现为瘤体体积及瘤体重量均显著下降。 结论：敲低HDAC7可负性调节内皮祖细胞的募集、嵌合、成管，抑制其结构性促血管新生功能；敲低HDAC7通过减少成管相关生长因子的表达，抑制内皮祖细胞非结构性促血管新生功能。 第三部分：内皮祖细胞通过HDAC7调控非小细胞肺癌血管新生的机制研究 目的：探讨HDAC7通过调控内皮祖细胞骨架重排及血管生成相关基因的转录，影响非小细胞肺癌血管新生的分子机制。 方法：应用鬼笔环肽染色比较HDAC7敲低前后内皮祖细胞的细胞骨架排布情况，并通过Western blot检测细胞骨架相关通路的激活。应用基因芯片技术检测HDAC7敲低后内皮祖细胞成管相关基因的转录变化，探查潜在的抗血管生成治疗靶点。 结果：鬼笔环肽染色提示HDAC7敲低后内皮祖细胞骨架过度激活，应力纤维聚合失衡，骨架排列紊乱，细胞收缩力增加；骨架相关通路ROCK/MLC2激活伴随ERK显著抑制，导致成管能力减弱。并且，ROCK抑制剂Y27632可以逆转上述现象，而ERK抑制剂U0126可重现上述现象，提示HDAC7可通过双向调节ROCK/MLC2和ERK信号通路，维持细胞骨架排布的平衡，确保内皮祖细胞的成管功能。Real-time PCR验证数个EPCs成管关键因子，结果提示敲低HDAC7一方面可抑制内皮祖细胞分化成熟，另一方面诱导抗血管生成因子表达、抑制促血管生成基因转录，维持肿瘤微环境趋向于抑制肿瘤血管新生。基因芯片的结果提供了EPCs成管功能相关基因的变化全景图，进一步支持HDAC7敲低后内皮祖细胞从骨髓到肿瘤部位的趋化、黏附、迁移、分泌等过程中相关细胞因子的转录均有不同程度变化，主要表现为血管新生抑制性因子表达上调，促进性因子转录下调，重塑了肿瘤血管新生的微环境。 结论：HDAC7通过ROCK/MLC2及ERK通路参与内皮祖细胞骨架重排，并通过控制成管相关基因的转录水平调节肿瘤微环境的血管新生开关。