铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种条件性致病菌，可以导致水貂的出血性肺炎。目前，水貂源铜绿假单胞菌相关研究多局限于感染菌株的流行血清型调查，但有关该病原菌毒力基因的研究鲜有深入报道。本研究旨在发掘铜绿假单胞菌的毒力基因，并研究该基因对宿主细胞的致病性。因此，本研究在流行病学调查的基础上，通过小鼠致病性实验筛选出强弱毒菌株，并通过比较转录组学测序及Real-time PCR验证的方法筛选获得与毒力相关的差异表达基因，构建差异表达基因缺失菌株，研究选定基因与毒力的相关性。试验具体分为以下几个部分：　　1. 铜绿假单胞菌流行病学调查　　从山东省不同采集地区分离鉴定获得的铜绿假单胞菌中选取水貂（60株）、人（16株）和羊源（2株）PA共78株分别进行O-抗原血清分型、H-抗原鞭毛分型以及脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型。结果显示：水貂PA感染与血清G型和鞭毛A型高度相关（P<0.01）；病人源PA感染优势血清型为E型且与鞭毛A型显著相关（P<0.01）；2株羊源PA感染均为血清I型和鞭毛B型；PFGE谱型显示所研究PA菌株彼此间亲缘关系复杂，水貂源PA分离株来源相同，但彼此亲缘关系存在差异。　　2. 水貂铜绿假单胞菌强弱毒菌株的筛选　　在流行病学调查的基础上选择代表菌株，采用小鼠感染模型，根据小鼠的死亡率来对分离株毒力进行判定。结果显示：相同攻毒剂量下，血清型G、B型菌株的致死率均较高（大于80%），M型和部分G型的致死率较低（小于20%）。筛选出两株强毒菌株11092618、11092304，两株弱毒菌株11082616、QT1进行后续实验。　　3. 水貂铜绿假单胞菌毒力基因的筛选鉴定　　对小鼠致病性试验筛选获得的PA强弱毒菌株进行比较转录组学测序，以菌株RNA为模板，采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit试剂构建文库，在Hiseq2500测序平台，进行2×100 bp测序。通过差异基因GO注释、KEGG注释等方法对测序结果进行基因注释及差异表达基因筛选，初步获得30个差异表达基因。随后以拷贝数恒定不变的16S rDNA基因序列作为内参，采用??CT （近似值法）默认扩增效率E=2 ，通过Real-time PCR验证，最终筛选出9个可能与毒力相关的差异表达基因。　　4. 水貂铜绿假单胞菌pyoS5基因毒力的相关研究　　于差异表达基因中，选定可编码产生绿脓菌素的pyoS5基因（pyoS5，11092618菌株，PA0985）进行基因敲除及其功能性研究。将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片段克隆入自杀质粒pCVD442中，利用缺失基因两端的同源片段，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性 DNA 片段可发生重组的原理，筛选获得基因敲除突变株11092618ΔpyoS5，并通过PCR扩增目的片段、DNA测序以及Real-time PCR的方法验证敲除准确。为了进一步研究pyoS5基因的毒力，进行11092618ΔpyoS5敲除突变株的相关生物学特性以及小鼠和水貂致病性试验，结果显示11092618ΔpyoS5较野生株相比，到达对数生长期的时间和生长速率没有明显差异；突变株不转录pyoS5基因（pyoS5， PA0985）；在不同攻毒剂量的小鼠致病性试验中，突变株的半数致死量LD50比野株低了一个数量级，毒力显著下降；在相同攻毒剂量的水貂致病性试验中，突变株的致死率也较野生株降低。结果表明pyoS5基因（pyoS5，PA0985）是铜绿假单胞菌的一个重要毒力基因。