论文部分内容阅读
疫苗是经济有效的预防传染病的手段,开发安全高效的新型疫苗是疫苗学研究的目标。亚单位疫苗和重组蛋白类疫苗的抗原是高纯度的蛋白质,疫苗的安全性得到了提高,但是存在免疫原性弱,激发的抗体反应不强,难以激发T细胞反应等不足。为了提高蛋白类疫苗的效力,研究者们一直在寻找高效的佐剂来增强抗原的免疫原性,诱导更强的免疫反应或改变免疫反应的类型。铝佐剂是使用最广泛、时间最长的人用疫苗佐剂。近年来,MF59、AS03、AS04和Virosomes等几种新佐剂逐渐获批人用。而植物多糖,因其较强的免疫调节功能,以及具有生物可降解和低毒性等优点,成为新型佐剂研究的一个热点。茯苓多糖PCP-I是从中药茯苓中提取纯化得到的一种均一多糖,由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。本研究以炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)为模式抗原,从体液免疫反应和细胞免疫反应两方面对PCP-I的佐剂效应进行了系统评价;观察了PCP-I与寡聚脱氧核苷酸CpG构成复合佐剂的佐剂效应;分别使用炭疽致死毒素(LT)攻毒模型和芽孢攻毒模型,对PCP-I增强PA保护效力的能力进行了考察;从树突状细胞(DC)成熟、生发中心(GC)反应和外周血单核细胞(PBMC)基因表达差异三个角度,对PCP-I佐剂效应的机制进行了初步探讨。首先对小鼠免疫实验中PCP-I的量效关系进行了考察。将0.5μg PA分别与50、200、500μg PCP-I混合,免疫BALB/c小鼠,免疫二次,间隔两周,在二免后两周取血检测anti-PA抗体和抗炭疽毒素中和抗体。结果表明,PCP-I为200μg时,小鼠血清中的antiPA抗体(5.38×103)和中和抗体(8.7×101)显著高于50μg组(1.54×102,2.65×101),略高于500μg组(4.15×103,6.13×101)。据此,选择200μg PCP-I进行后续的实验。为评价PCP-I对体液免疫的影响,以0.5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂(Al),免疫BALB/c小鼠,并设PA无佐剂组和PBS组分别作为阴性和空白对照,免疫三次,间隔两周,在三免后两周取血进行相关检测。PA+PCP-I组的anti-PA抗体滴度(1.81×104)和抗体亲和力(0.81)显著高于PA组(1.60×103,0.52),而与PA+Al组(2.35×104,0.83)相近。对anti-PA抗体亚类进行分析,发现PA+PCP-I组的IgG1显著高于IgG2a(5.12×104,2.93×1 03),提示PCP-I是Th2偏向型佐剂。毒素中和实验结果表明,PA+PCP-I组的中和抗体(2.55×103)显著高于PA组(1.32×102),与PA+Al组(1.76×103)无显著性差异。为评价PCP-I对细胞免疫的影响,以5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂免疫小鼠,PA无佐剂组和PBS组作对照,在三免后两周取脾细胞进行细胞免疫相关检测。PA+PCP-I组小鼠脾脏中PA特异性记忆B细胞的频率(4.26%)显著高于PA组(0.87%),与PA+Al组(5.39%)无显著性差异,表明PCP-I能够增强B细胞记忆。使用CCK8检测脾细胞在体外接受PA刺激后的增殖情况,PA+PCP-I组小鼠脾细胞增殖指数(1.37)显著高于PA+Al组(1.05)和PA组(1.08),表明PCP-I能提高小鼠脾细胞再次接触抗原后的增殖能力。使用ELISPOT检测脾细胞中IL-4、IFN-γ分泌细胞的频率,PA+PCP-I组IL-4分泌细胞频率(92/106)高于PA+Al组(34/106),而IFN-γ分泌细胞的频率无明显差异。用细胞因子芯片对PA刺激培养的脾细胞上清中各细胞因子的含量进行检测,PA+PCP-I组IL-2、IL-4、IL-5的含量(63.5、23.0、1020.8pg/ml)显著高于PA+Al组(17.0、2.6、5.1pg/ml),表明PCP-I增强了记忆T细胞再次接触抗原后分泌相应细胞因子的能力。使用炭疽致死毒素(LT)对免疫后小鼠进行攻毒,观察存活率。PA组和PBS组小鼠全部死亡,PA+PCPI组小鼠存活率为75%。为评价PCP-I与CpG构成的复合佐剂的佐剂效应,使用0.5μg PA混合不同的佐剂免疫BALB/c小鼠,在三免后两周取血进行检测。PA+PCP-I+Cp G组的anti-PA抗体(1.02×105)显著高于PA+PCP-I组(1.81×104)和PA+CpG组(3.49×103);抗体亲和力(0.73)显著高于PA+CpG组(0.52),略低于PA+PCP-I组(0.81)。抗体亚类分析表明,PA+PCP-I+CpG组的IgG1与PA+PCP-I组相当(7.90×104,5.12×104),而IgG2a显著高于后者(5.12×104,2.93×103),说明联合佐剂使得PA特异性体液免疫反应呈现Th1/Th2均衡。PA+PCP-I+CpG组的中和抗体(1.38×104)显著高于PA+PCP-I组(2.55×103)和PA+CpG组(1.62×103)。上述结果说明复合佐剂能够以Th1/Th2均衡的方式提高anti-PA抗体,血清中和毒素的能力也显著提高。使用LT对小鼠进行攻毒,观察存活率。PA+PCP-I+CpG组的存活率与PA+PCP-I组相同(75%),略高于PA+CpG组(50%)。为更直接地对佐剂增强PA免疫保护的能力进行评价,用0.5μg PA混合不同的佐剂免疫对炭疽芽孢攻击敏感的A/J小鼠,三免后两周取血检测,三免后四周使用炭疽杆菌A16R株芽孢进行攻毒。检测结果显示,PA+PCP-I组的anti-PA抗体和中和抗体(7.18×103,2.42×102)低于PA+Al组(3.23×104,3.49×103),而PA+PCP-I+CpG组的抗体和中和抗体(3.23×104,2.29×103)与PA+Al组相当。芽孢攻毒后,PA+PCP-I+CpG组和PA+Al组小鼠全部存活,PA+PCP-I组小鼠存活率为83%。PCP-I单独使用的佐剂效应在A/J小鼠实验中不如BALB/c小鼠,由于A/J小鼠属于补体成分5(C5)缺陷型小鼠,推测PCP-I的佐剂效应可能与激活补体途径相关,而CpG的加入能够在一定程度上弥补C5缺失对PCP-I佐剂效应的不利影响。为探讨PCP-I的作用机制,从DC成熟、GC反应和PBMC基因表达差异三个角度进行了初步研究。分别使用PA+PCP-I、PA+Al、PA刺激培养骨髓来源的DC,之后用流式细胞仪检测DC表面CD80和MHC-II的表达。PA+PCP-I刺激组DC中CD80阳性细胞的比例(82.2%)显著高于PA组(51.7%),略高于PA+Al组(65.1%);PA+PCP-I组DC中MHC-II阳性细胞的比例(74.9%)显著高于PA组(46.8%)和PA+Al组(56.1%)。说明PCP-I能够诱导DC上调CD80和MHC-II表达,促进DC成熟。使用5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂免疫BALB/c小鼠,免疫两次,间隔两周,在二免后7天取脾细胞利用流式细胞术检测GC B细胞和滤泡状辅助T细胞(Tfh)的频率。PA+PCP-I组小鼠脾脏中GC B细胞(7.73%)频率显著高于PA组(6.30%),Tfh细胞的频率略高于后者(4.97%vs 4.20%),提示PCP-I能促进生发中心反应。使用转录组测序技术,观察PA+PCP-I、PA+Al和PA免疫3天后PBMC中基因表达的差异。通过数据分析,PA+PCP-I组和PA组之间比较筛选到66个差异基因,其中53个基因与PA+Al组和PA组间差异基因重叠,13个基因是PCP-I特异的差异基因。对这13个基因进行功能注释,发现Il1r2、Clec4e、Stab1和C5ar1与免疫反应相关,其中C5ar1编码C5aR,参与补体C5a对特异性免疫的调节,与PCP-I的佐剂效应与C5相关的假设相符。综上所述,PCP-I作为一种植物多糖类疫苗佐剂,其增强体液免疫反应能力与铝佐剂相当,增强细胞免疫反应的能力强于铝佐剂;当PCP-I与CpG构成复合佐剂后,以Th1/Th2均衡的方式进一步增强了体液免疫反应;初步的机制分析发现,PCP-I可通过促进DC成熟和增强生发中心反应,来增强抗原特异性免疫反应,其作用机制还可能与补体C5和C5aR相关。