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第一章脐带间充质干细胞的分离培养鉴定及体外分化研究背景脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)主要来自母体妊娠后的脐带,具有强大的细胞分化潜力和细胞增殖能力,其来源丰富,安全,不存在伦理问题且分化潜力较高在临床研究中具有很高的价值。脐带间充质干细胞在体外可被诱导分化为具有神经功能的细胞,在脐带干细胞移植治疗脑卒中等神经损伤疾病的研究中,给予大鼠静脉注射脐带间充质干细胞后,发现大鼠的运动行为明显改善。但脐带间充质干细胞治疗神经损伤类疾病的治疗机理仍不明确。研究目的1.体外获取脐带间充质干细胞并进行流式鉴定。2.利用细胞因子进行脐带间充质干细胞的体外成神经诱导分化并进行鉴定。3.模拟体内环境,构建脐带间充质干细胞体外炎症模型,探讨共移植细胞因子对脐带间充质干细胞的影响。研究方法1.脐带间充质干细胞的分离获取孕鼠脐带组织并使用PBS缓冲液洗净血液,将组织分割后加入胰酶消化并制备单细胞悬液,进行细胞计数。2.脐带间充质干细胞的培养将计数后的细胞,置入含有DMEM/F12的培养基中进行培养并传代。3.脐带间充质干细胞的流式鉴定取生长到70%～80%的细胞制备密度为5×106的单细胞悬液,分别加入流式细胞术所用的单克隆FITC抗体,利用流式细胞仪检测细胞表面分子特征。4.脐带间充质干细胞的体外成神经分化待培养的细胞密度生长至70%～80%时,加入诱导培养基培养并观察。5.脐带间充质干细胞体外成神经分化的免疫荧光染色诱导分化后的细胞使用PBS缓冲液洗涤、4%PFA固定、封闭液封闭后进行免疫荧光染色并使用荧光显微镜观察记录。6.细胞因子对脐带间充质干细胞活性的影响模仿体内炎症环境,使用白介素1β(IL-1β)刺激脐带间充质干细胞构建炎症细胞模型并进行分组并测定细胞活性,然后分别加入共移植细胞因子和PBS并测定细胞活性。结果1.从脐带中分离获取干细胞表面标记物的表达与脐带干细胞一致,并且符合文献报道。2.脐带间充质干细胞在体外可以被诱导分化表达GFAP和Tuj1。3.细胞炎症模型中,IL-1β可以抑制细胞活性,而共移植的细胞因子可以降低这种抑制作用,对细胞发挥保护作用(P<0.05)。4.IL-1β可以降低细胞增殖相关蛋白Pi3k和AKT的表达和磷酸化水平,同时可以上调凋亡相关蛋白caspase3的表达,共移植因子可以抑制IL-1β导致的Pi3k和AKT表达的降低,抑制caspase3的表达(P<0.01)。结论1.我们成功分离获取的干细胞符合脐带间充质干细胞在体外可以被诱导分化高表达神经胶质细胞标志物GFAP和Tuj 1。2.炎症条件下,共移植细胞因子可以提高脐带间充质干细胞的细胞活性,促进脐带间充质干细胞的存活,抑制其凋亡。第二章外伤性脑损伤大鼠模型的建立及脐带间充质干细胞的移植研究背景脑损伤性疾病(Traumatic brain injuries,TBI)通常是由外力引起的脑部神经损伤,造成大脑不同程度的损伤而引起一系列的神经功能失调。除急性损伤外,继发性损伤也是神经损伤类疾病的致残结局中的重要因素,脑部损伤后引发的炎症反应,血管压迫及断裂导致的血栓和低血流,导致脑局部卒中,从而造成酸性,缺氧的微环境,进一步导致损伤神经元的凋亡。由于神经系统的不可逆性,脑部神经元损伤死亡后会造成不可逆的神经功能缺陷,但目前尚无有效手段能够治疗脑损伤导致的神经功能缺陷,随着干细胞技术的研究进展,干细胞移植成为治疗神经损伤类疾病的潜在的有效治疗手段,本实验通过动物模型及脐带间充质干细胞移植,探究脐带间充质干细胞的治疗效果和治疗方案。研究目的构建大鼠外伤性脑损伤模型后移植脐带间充质干细胞,探究脐带间充质干细胞在改善动物模型行为和神经功能评分中的治疗作用。研究方法1.大鼠模型的构建将大鼠麻醉后自由落体打击法构建大鼠脑损伤模型并随机分为4组:共移植组、干细胞移植组、细胞因子组和PBS组,同时设立未损伤对照组。2.术后大鼠行为学检测和神经功能损伤评分术后1,2,3,4周对所有大鼠模型严格按照神经功能损伤评分表进行神经功能损伤评分,并与对照组进行对比。3.脐带间充质干细胞的移植将分离获取的脐带间充质干细胞密度调整为1×106/uL,然后在损伤处原位进行细胞注射,速度为1uL/min,注射体积为5uL,共注射细胞量为5×106。留针10min后再缓慢撤针。4.细胞移植后大鼠行为学检测和神经功能损伤评分脐带间充质干细胞或细胞因子移植后,1,2,3,4周对四组模型组大鼠和对照组大鼠进行行为检测和神经功能损伤评分。结果1.大鼠模型的构建及术后行为和神经功能损伤评分我们构建的外伤性脑损伤大鼠模型存活率为98%,且脑损伤大鼠模型的稳定性和均一性较好。脑损伤模型鼠和对照组大鼠行为和神经功能损伤评分差异明显。2.脐带间充质干细胞的移植与移植后行为和神经功能损伤评分分别向四组脑损伤大鼠模型脑损伤部位原位移植脐带间充质干细胞和共移植细胞因子、脐带间充质干细胞、细胞因子以及PBS缓冲液对照。按照神经功能损伤评分表进行评分发现,共移植组评分低于干细胞移植组(P<0.05),干细胞移植组评分低于细胞因子组和PBS组(P<0.01)。结论1.我们使用自由落体打击模式构建的脑损伤大鼠模型具有较高的成功率与存活率,大鼠模型之间具有较好的稳定性和均一性。2.行为学检测和神经功能损伤评分表明共移植组的治疗效果优于干细胞移植组,而干细胞移植组治疗效果优于细胞因子组和PBS组。表明脐带间充质干细胞和共移植细胞因子的相互作用更有利于脑损伤疾病的治疗。第三章脐带间充质干细胞及细胞因子共移植治疗脑损伤疾病的分子机理的研究研究背景脑损伤性疾病一直是严重威胁人类健康及生活的致残性损伤疾病,目前尚无有效的治疗办法。随着干细胞移植技术的不断进展,脐带间充质干细胞由于来源丰富,分化潜力高,无致瘤性与伦理学限制,其在临床研究中具有重大价值和意义。但目前关于脐带间充质干细胞治疗神经损伤类疾病的分子机理仍不明确。研究目的本研究通过共移植脐带间充质干细胞和细胞因子探究其治疗脑损伤疾病的分子机理和治疗机制。研究方法1.免疫荧光染色检测移植脐带间充质干细胞在体内的存活情况将细胞移植后的大鼠进行脑冰冻切片,采用免疫荧光染色检测移植的脐带间充质干细胞在体内的存活及分化情况。2.ELISA检测脐带间充质干细胞移植前后脑损伤区域细胞因子的表达变化使用ELISA试剂盒检测神经营养因子GDNF,BDNF以及炎症因子IL-1β和TNF-α的表达。3.Western Blot检测脐带间充质干细胞移植前后脑损伤区域与细胞增殖和凋亡相关蛋白分子的表达检测与细胞增殖相关蛋白Pi3k,AKT以及磷酸化水平的表达变化,同时检测凋亡相关蛋白caspase3的表达变化。结果1.脐带间充质干细胞在体内的存活与分化情况将移植脐带间充质干细胞4周后的大鼠脑组织进行冰冻切片进行免疫荧光染色,染色结果表明,移植的脐带间充质干细胞在体内可以分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,而细胞因子组与PBS组均未发现GFAP阳性的神经胶质细胞的大量聚集。2.神经营养因子和炎症因子在脐带间充质干细胞移植前后的表达变化脐带间充质干细胞移植2周后,干细胞移植组及共移植组神经营养因子BDNF和GDNF的表达水平高于细胞因子组和PBS组(P<0.05),移植4周后营养因子表达水平明显高于细胞因子组和PBS对照组(P<0.001),同时共移植组神经营养因子表达水平高于干细胞移植组(P<0.05)。而炎症因子的表达与神经营养因子相反,干细胞移植2周后炎症因子表达水平低于细胞因子组和PBS对照组(P<0.05),干细胞移植4周后炎症因子表达水平明显降低(P<0.001),同时共移植组中炎症因子表达水平低于干细胞移植组(P<0.05)。3.细胞增殖和凋亡相关蛋白分子的表达共移植组p-Pi3k和p-AKT的表达高于干细胞移植组(P<0.05),干细胞移植组高于细胞因子组和PBS组(P<0.01),而caspase的表达相反,即共移植组表达水平低于干细胞移植组(P<0.05),干细胞移植组低于细胞因子组和PBS 组(P<0.01)。结论1.移植的脐带间充质干细胞可以在脑损伤区域的存活并分化为神经胶质样细胞。存活和分化的脐带间充质干细胞不仅可以增强神经营养因子BDNF和GDNF的表达,还可以降低炎症因子IL-1β和TNF-α的表达。2.移植的脐带间充质干细胞通过上调细胞存活和增殖相关蛋白Pi3k、AKT的表达,抑制凋亡相关分子caspase3的表达抑制损伤神经元的凋亡,促进其存活和增殖重塑。3.将共移植组与干细胞移植组和细胞因子组分别比较后我们推测:共移植的细胞因子可能通过提高移植的脐带间充质干细胞的活性和促进脐带间充质干细胞的存活和分化发挥共移植治疗作用。