D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）是生产羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄和头孢哌酮等半合成抗生素的中间体,市场需求量大。海因酶法指利用D-海因酶和D-氨甲酰水解酶为催化剂,催化D-对羟基苯海因（D-HPH）经中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸,生成D-HPG的生化反应方法,是最有潜力的D-HPG生产方法。本文研究在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶和D-氨甲酰水解酶,构建具有双酶活性的重组Bacillus subtilis,作为海因酶法生产D-HPG的全细胞催化剂。以Bacillus subtilis 168N为出发菌,用羟基丁酮诱导表达系统,整合表达Bacillus stearothermophilus SD-1的D-海因酶（hyd_a基因）,构建重组菌株LS10,进而构建了hyd_a基因表达质粒pHPS和pUBS,以及具有D-海因酶活性的菌株168N/pHPS和168N/pUBS。培养基中的Mn²⁺显著提高168N/pUBS菌株的D-海因酶活性,用含有0.16 g/L MnCl₂·4H₂O的LB培养基诱导培养168N/pUBS菌株,其全细胞的D-海因酶活性达到956 U/gDCW。在sigL基因组成型表达背景下,不同程度过表达acoR基因。结果显示,当acoR基因转录水平提高302.33倍,严重降低带有单拷贝hyd_a基因的LSL13菌株的D-海因酶活性;当acoR基因转录水平提高2.11倍,LSL01/pHPS的D-海因酶活性达到1230 U/gDCW;当acoR基因转录水平提高63.56倍,LSL02/pUBS的D-海因酶活性达到1470 U/gDCW。结果表明,AcoR蛋白的胞内水平影响高拷贝hyd_a基因的表达。在Bacillus subtilis中,表达来自Agrobacterium sp.KNK712的D-氨甲酰水解酶（adc基因）。启动子筛选和优化结果显示,启动子P_AE2的表达水平相对最高。带有adc_a2基因的LSL04s菌株,经培养基优化后D-氨甲酰水解酶活性达到22.1 U/gDCW;而adc_a2基因点突变菌株的D-氨甲酰水解酶酶活性均显著下降。高拷贝hyd_a和adc_a2基因共表达质粒pUBSC,以及具有双酶活性的菌株LSL02/pUBSC被构建。采用烘焙豆粉和酵母粉作为迟效氮源,诱导培养22 h,使LSL02/pUBSC的全细胞催化活性达到64.6 U/gDCW。在40℃、pH 8.0,底物初始浓度为20 g/L的最适反应条件下,LSL02/pUBSC全细胞催化活性能够持续12 h,使HPH的转化率达到95%,D-HPG产量为14.32 g/L,收率达到82.4%,产率为1.19 g/L/h。