目的和意义FHL2(Four and a halfLIM Protein 2)为确定的癌基因,在胃肠道肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。最近已有研究报道了FHL2下游的转录调控,但其上游的相关调控报道甚微。结合文献,我们通过软件筛选出转录因子KLF8 (Kruppel-like factor 8)为FHL2可能的调控因子。Kruppel-like factor 8(KLF8)是作为K ruppel样Cys2/His2锌指转录因子蛋白质家族的一个转录抑制蛋白而被识别的,通过与辅抑制子碳端结合蛋白(CtBP)相联系抑制基因表达。最近有研究表明KLF8在卵巢癌、肾癌以及乳腺癌中表达是升高的,但是在肠癌组织细胞中的表达及其与肠癌发生、侵袭转移尚无相关报道。同时本课题旨在明确KLF8与FHL2上游启动子序列的转录调控关系,从而寻找能靶向调控FHL2表达的元件,以期应用于肿瘤的生物靶向治疗。材料和方法主要材料Lovo、SW480、SW1116、Caco2、SW620.HT29和DLD1细胞,rTGF-β1、TGF-β1中和抗体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CHIP试剂盒、突变试剂盒、KLF8抗兔多克隆抗体、FHL2抗鼠多克隆抗体、罗丹明标记鬼笔环肽。主要方法1.KLF8对肠癌EMT及侵袭转移的影响1.1 KLF8过表达稳定株的构建及KLF8对肠癌EMT的影响转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒到Lovo细胞,48小时后用含有600μg/mlG418的培养基继续培养2周,挑选单克隆细胞,并用800μg/ml G418培养基继续培养,建立单克隆稳定表达株,western blot验证稳定克隆细胞中KLF8的表达情况。western blot检测转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒细胞中的E-cadheri、Vimentin及N-cadhenrin的表达情况。1.2 KLF8对肠癌细胞侵袭转移的影响接种适当密度转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒细胞至6孔板中,待融合度近100%时,用移液器枪头进行划痕,镜下记录划痕区相对距离,继续培养,分别于12和24小时再次拍照记录,评估肠癌细胞的转移能力；种转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒的单细胞悬液(5×105/室)至Matrigel侵袭小室,室内为无血清培养基,室外为10%胎牛血清培养基,常规培养24小时,0.2%结晶紫染色,显微镜下计数发生侵袭的细胞数量,评价高表达KLF8对细胞侵袭能力的影响。1.3 rTGF-β1对KLF8及EMT的影响western blot检测不同浓度(0、0.5、1.0、2.0ng/ml) rTGF-β1处理Lovo细胞后蛋白中KLF8、E-cadherin 和vimentin的表达。用含有2μg/ml TGF-β1的中和抗体及对照正常鼠IgG抗体(normal mouse IgG, mIgG)的培养基孵育SW480细胞过夜,第二天分别加或不加rTGF-β1 (2ng/ml)刺激,继续孵育48小时,western b lot方法检测KLF8、E-cadherin和vimentin的表达。转染KLF8-siRNA和对照Scr-siRNA入Lovo细胞,24小时后加或不加rTGF-β1,继续孵育48小时,western blot检测KLF8、E-cadherin和vimentin的表达。2.KLF8和FHL2在原发性肠癌、转移癌组织及细胞内的表达情况2.1 KLF8和FHL2在原发性肠癌及转移癌组织中的表达收集15对以上来自同一肠癌病人的原发与转移癌(淋巴结或肝转移)手术标本,在连续切片中分别应用KLF8和FHL2抗体进行免疫组织化学染色。2.2 KLF8和FHL2在肠癌细胞内的表达提取Lovo, SW1116, SW620, HT-29, DLD1, CaCo2, SW480的细胞蛋白,用western blotti ng技术检测不同肠癌细胞中KLF8和FHL2的表达水平,并间接免疫荧光染色方法检测KLF8与FHL2两蛋白的细胞内亚分布。3.KLF8与FGL2的关系3.1 FHL2启动子区域内KLF8的结合位点通过使用生物信息学软件预测FHL2启动子区域内的KLF8结合位点,为了获得更多KLF8与FHL2启动子结合的证据,我们利用染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法,探索FHL2启动子区域内KLF8的结合位点。3.2双荧光素酶检测FHL2启动子区域内KLF8结合位点的活性根据FHL2启动子(500bp)内KLFs的位置设计三对引物,扩增FHL2基因5’端上游启动子序列,分别插入到pGL3-Basic载体,构建质粒pluc55、pluc201和pluc498,瞬时转染入不同KLF8表达状态的肠癌细胞,进行双荧光素检测。3.3定点突变重组质粒并检测其活性变化按照突变试剂盒设计突变引物,以pluc-55为模板进行扩增得到KLF8结合位点突变的产物,产物用DpnI酶切可将未突变的模板质粒清除,然后转化入Epicurian coli XL 1-blue感受态细胞扩增,再将突变质粒测序鉴定后命名为plucMT。将突变质粒转染入细胞内48小时后收集细胞进行双荧光素酶报告基因检测。4.下调FHL2对KLF8诱导的结直肠癌EMT的影响及其对KLF8诱导的结直肠癌增殖、侵袭转移能力的影响4.1 FHL2低表达对KLF8诱导的EMT的影响在KLF8过表达稳定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDNA3.1-KLF8)中,瞬时转染Scr-RNA或FHL2-siRNA,48小时后,vestern blot检测FHL2、E-cadherin、 Vimentin、N-cadherin表达；另外用免疫荧光染色实验观察E-cadherin和 Vimentin在Lovo-KLF8-src-siRNA和SW480-KLF8-FHL2-siRNA两个细胞中分布的变化。4.2 FHL2低表达对KLF8诱导的结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响(1)WST-1实验验证FHL2对KLF8调节的结直肠癌细胞增殖的影响在过表达KLF8稳定株(Lovo-pcDNA3.1-KLF8)中,瞬时转染FHL2-siRNA或Scr-RNA,分别种植0、24、48、72小时后的单细胞悬液于96孔板中,继续培养24小时,向每孔中加入10μl WST-1溶液,4小时后测定450nm处的吸光度。(2)压低FHL2表达对KLF8诱导的肠癌细胞侵袭和转移能力的影响取适当密度KLF8过表达稳定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDN A3.1-KLF8)瞬时转染Scr-RNA或FHL 2-siRNA后的单细胞悬液铺板于六孔板中,待细胞长满后,用移液器枪头划痕,分别于划痕后0h、12h、24h显微镜下拍照,记录划痕情况；种KLF8过表达稳定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDNA3.1-KLF8)瞬时转染Scr-RNA或FHL2-siRNA后的单细胞悬液(5×105/室)至Matrigel侵袭小室,室内为无血清培养基,室外为10%胎牛血清培养基,常规培养24小时,0.2%结晶紫染色,显微镜下计数发生侵袭的细胞数量,评价压低FHL2对KLF8诱导的侵袭能力的影响。(3)FHL2siRNA对过表达KLF8引起的肠癌细胞形态的影响显微镜白光下观察过表达KLF8稳定株瞬时转染FHL2-siRNA或Scr-RNA48小时后细胞形态；盖玻片上培养过表达KLF8稳定株瞬时转染FHL2-siRNA或Scr-RNA后的细胞,48小时后取出,并进行罗丹明鬼笔环肽染色,经过PBS洗涤后,于荧光显微镜下观察细胞形态。5.压低FHL2表达对KLF8诱导的体内侵袭转移作用的影响5.1皮下肿瘤模型的建立给5-6周龄大小的BALB/c雌性裸鼠皮下分别注射转染pcDNA3.1、 pcDNA3.1-KLF8-FHL2 siRNA的细胞,35天后处死,对比三组皮下肿瘤大小；肿瘤连续切片免疫组化验证Ki-67和CD105的表达情况。5.2脾被膜下肝转移模型的建立给5-6周龄大小的BALB/c雌性裸鼠脾被膜下分别注射转染pcDNA3.1. pcDNA3.1-KLF8.pcDNA3.1-KLF8-FHL2siRNA的细胞,3周后处死,观察体内肝脏转移瘤大小；并用qRT-PCR验证三组肝肿瘤内E-cadherin的表达。6.数据的统计学处理IHC每张切片随机选取3-5个不同视野,计算目的蛋白阳性细胞表达率,并进行两个样本的配对t检验；双荧光素酶报告基因检测、PCR、细胞粘附、侵袭、转移和westrnm blotting灰度值分析结果用三次实验结果先进行方差齐性检验,方差齐(P>0.05)则进行两个处理组间独立样本t检验或多个处理组间one way ANOVA统计分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法；方差不齐(P<0.05)则应用S atterthwaite近似t检验或Welch检验分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用Duunett’s T3检验。应用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据采用均数+-标准差表示,p<0.05具有显著性差异。结果1.KLF8促进肠癌EMT及侵袭转移1.1过表达KLF8对肠癌细胞EMT的作用通过western blot证实KLF8与E-cadherin血呈负相关关系,与V imentin、 N.cadherin呈正相关关系。1.2 KLF8对肠癌细胞侵袭转移的作用划痕和侵袭实验表明KLF8表达水平与肠癌细胞的侵袭转移能力呈正相关。1.3 rTGF-β1对KLF8及EMT的影响肠癌细胞内KLF8的表达对rTGF-β1存在剂量依赖性,浓度越高的rTGF-β1导致KLF8的表达增高,并且降低E-cadherin而增加Vimentin的表达水平；内外源性rTGF-β1引起的KLF8表达均可以受到TGF-β1中和抗体的抑制；KLF8siRNA阻断了rTGF-β1引起的Vmehtin的表达,而增加E-cadherin表达。2.KLF8与FHL2在肠癌组织和细胞中的表达关系2.1 KLF8与FHL2在原发性肠癌及转移癌组织中的表达免疫组化实验证实KLF8与FHL2在肠癌组织中表达水平均显著高于邻近正常肠组织,且同位点胞浆和胞核内均有表达,通过Spearman分析得出二者表达呈正相关；二者在转移癌中的表达均呈阳性表达。2.2 KLF8与FHL2在肠癌细胞内同向表达并具有相关性Western blot证实,KLF8在肠癌细胞SW480、SW1116、Caco2和SW620均呈高表达,而在HT29、DLD1和Lovo细胞内呈较低表达。FHL2在上述肠癌细胞内的表达趋势与KLF8一致,除SW480外。并且间接免疫荧光实验显示KLF8与FHL2的表达位于Lovo的胞核和胞浆内。3.FHL2是KLF8转录活性的直接目标3.1 FHL2启动子区域存在KLF8结合位点生物信息学分析发现：在FHL2启动子500bp内存在3个GT盒子：分别位于-50-55bp(GT盒子1),-192--201bp(GT盒子2)和-493--498bp(GT盒子3)。CHIP结果发现：加了KLF8抗体组内GT盒子1处有条带出现,加了对照抗体IgG和未加KLF8抗体处均未见条带出现。3.2双荧光素酶基因报告实验证明KLF8与GT盒子1结合将FHL2启动子区域内的三个GT盒子接入pGL3-Basic载体中,构建重组质粒转染入Lovo-pcDNA3.1、Lovo-pcDNA3.1-KLF8中进行双荧光素酶检测,结果显示：转染含有GT盒子1质粒的高表达KLF8细胞组活性明显高于对照组,转染含GT盒子2和GT盒子3质粒的高表达KLF8细胞组与对照组细胞无明细差异。3.3定点突变重组质粒对FHL2启动子活性的影响按照定点突变试剂盒突变设计突变引物,以重组质粒pLuc-55为模板,构建突变质粒pluc-MT,将野生型和突变型质粒分别转入不同KLF8表达状态的肠癌细胞进行双荧光素酶检测,显示：转染野生型质粒的高表达KLF8细胞组活性明显高于对照组,而转染突变型质粒的高表达KLF8细胞组与对照组无明细差异。4. FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌细胞的EMT和肠癌细胞增殖、侵袭转移能力,并影响KLF8诱导肠癌细胞形态的变化4.1 FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌细胞的EMTWestern blot证实：在KLF8过表达稳定株中转染FHL2-siRNA可促进E-cadherin的表达,并且抑制Vimentin和N-cadherin的表达。免疫荧光实验结果同样证实：在KLF8稳定表达株中压低FHL2可促进E-cadherin的表达,抑制Vimentin的表达。4.2 FHL2siRNA抑制KLF8诱导的结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力增殖试验提示转染FHL2-siRNA的KLF8过表达稳定株的OD450s明显低于转染Scr-RNA的KLF8过表达稳定表达株。对比0h、12h、24h的划痕实验结果,敲低KLF8过表达稳定株中FHL2的表达引起肠癌细胞迁移速度的降低；Transwell试验显示KLF8过表达稳定株转染FHL2-siRNA后的细胞侵袭率明显低于KLF8过表达稳定株。4.3 FHL2低表达对KLF8引起的肠癌细胞形态变化的影响KLF8过表达稳定株细胞呈现出一种细长如成纤维细胞的形态,而对照细胞及转染FHL2-siRNA的KLF8稳定表达株均呈现出圆的和平坦的细胞形态。罗丹明结果显示：过表达KLF8稳定细胞边缘地带突出,而且丝状伪足和板状伪足是细胞膜表面的动态特征,与癌细胞侵袭和转移有关,而转染FHL2-siRNA的KLF8稳定表达株细胞边缘未伸出伪足。5.FHL2低表达对体内KLF8诱导的侵袭转移作用的阻断5.1 FHL2低表达减小KLF8诱导的裸鼠皮下肿瘤大小裸鼠皮下成瘤,对比三组皮下肿瘤大小,转染pcDNA3.1-KLF8细胞组的肿瘤明显大于转染p cDNA3.1及在KLF8高表达FHL2低表达稳定株的细胞组肿瘤；另外肿瘤切片免疫组化结果证实：在注射KLF8过表达稳定株组中,Ki-67和CD105的表达明显高于另外两组。5.2 FHL2低表达抑制KLF8诱导的体内转移脾被膜下注射三组细胞23天后处死,观察结果提示：注射KLF8过表达稳定株组的肝脏转移瘤比另外两组较大；qRT-PCR证实：KLF8过表达稳定株内E.cadherin的mRNA表达水平较对照组及KLF8过表达而FHL2低表达稳定株低。结论1.KLF8促进肠癌的EMT及侵袭转移活性；2.FHL2和KLF8在肠癌及转移瘤组织细胞中的表达呈正相关；3.CHIP实验、双荧光素酶、基因突变实验相互印证在FHL2启动子区域55bp处存在KLF8结合位点；4.FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌EMT和肠癌细胞增殖、侵袭转移能力,并改变其诱导的细胞形态变化；5.体内实验再次印证FHL2参与调节KLF8诱导的EMT和侵袭转移。FHL2为癌基因,KLF8是正向调节肠癌的发生、发展及侵袭转移的转录因子,FHL2和KLF8的相互作用,在大肠癌EMT及侵袭转移中具有重要作用。KLF8 promotes tumorigenesis, invasion and metastasis of colorectal cancer cells by transcriptional activation of FHL2