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细胞是生命体基本的结构和功能单元,并且每个细胞都是独一无二的。发展单细胞的转录组研究方法对深入研究细胞基因调控通路,细胞的异质性行为和复杂的疾病发生机制至关重要。本论文通过核酸探针设计和恒温扩增技术构建了细胞内单分子水平、单碱基分辨和高通量的RNA原位成像技术,为细胞基因转录及转录后调控等过程研究提供了一个单细胞分析平台。具体内容和主要结果如下:1、miRNA是细胞内具有重要基因调控功能的非编码RNA,并与癌症、心血管疾病、神经性疾病等的发生密切相关。由于miRNA具有序列短、序列相似等特征,使其分析检测面临巨大挑战。我们通过设计一个结构可切换的哑铃型模板,利用热力学可控的Toehold介导的核酸链置换过程引发滚环扩增反应(TIRCA),对miRNA的进行高特异性识别和原位扩增,实现细胞内miRNA单分子水平的原位成像。TIRCA方法具有比基于锁式探针的RCA技术更高的特异性,能够明显区分只有单碱基差异的同一家族的miRNA let-7a、let-7f和let-7c。单细胞miRNA分析结果表明,在同一种细胞内的miRNA的表达也都存在显著差异,这种异质性突出说明了单细胞分析对细胞功能、行为等研究的重要意义。2、发展了一种不依赖逆转录过程的细胞内高效率的、单分子和单碱基分辨的mRNA荧光原位成像的方法。通过利用一个最近发现适用于RNA检测的Splint R连接酶和锁式探针实现对mRNA特异性地识别。Splint R连接酶能够以RNA为模板高效率的催化连接锁式探针,实现对mRNA高效的检测(检测效率超过20%)。该方法通过探针连接反应作为目标RNA识别过程,因此具有非常高的特异性,能够识别具有单个碱基差异的mRNA序列,可以被用于单细胞水平的碱基突变分析。单细胞mRNA的成像结果显示具有不同功能的mRNA可能在细胞内呈现不同的亚细胞水平上的空间分布,功能相关的基因表达可能会存在相关性。3、RNA荧光成像的通量受限于可分辨的荧光标记数目(3-4种),考虑到DNA序列的可编程性和核酸杂交的可精确控制性,我们提出了一个基于调控核酸杂交热力学的DNA序列编码的荧光标记技术(SeqEA)。SeqEA技术可以用于多重的RNA原位标记,实现细胞内高通量的、单分子水平、单碱基分辨的RNA原位成像。这种具有高通量、高空间分辨和高序列分辨的RNA成像技术有希望成为一个新的单细胞分析平台用于包括细胞基因的调控网络及其机制研究、单碱基突变和RNA选择性剪切过程的分析。