卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,占女性恶性肿瘤的3%,位居乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、黑素瘤、非何杰金淋巴瘤和肾脏肿瘤之后。卵巢癌占女性生殖系统恶性肿瘤的15%。卵巢癌组织类型多种多样,以浆液性肿瘤为最常见的上皮组织类型。尽管近十年在卵巢癌诊断和治疗中取得了很多进展,但卵巢癌仍然是一种高致死性疾病。高死亡率的原因主要是缺乏早发现、早确诊的有效手段和患者对化疗产生了耐药性导致癌症复发。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)是参与碱基切除修复(base excision repair,BER)途径的一个多功能酶,APE1能够修复由外源性或内源性刺激造成的氧化应激的碱基损伤。APE1还可以作为多个转录因子的还原性促活剂,因此又被称作氧化还原因子1(redox effector factor 1,Ref-1)。APE1能够活化激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、p53,对细胞凋亡、炎症、血管生成和生存等各个方面都有重要作用。APE1/Ref-1通过活化参与不同生理过程的转录因子来维持细胞的氧化还原的稳态,而且还能够调控活性氧和活性氮,与维持氧化还原平衡的物质进行交互,如硫氧还蛋白、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等。APE1/Ref-1调控的生理功能包括BER途径、转录因子、能量代谢、细胞骨架物质和应激相关反应等。通过自身的异常调节、翻译后修饰或者序列多态性等机制,多功能酶APE1与多种疾病的发生相关,特别是不同类型的肿瘤,如卵巢癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌等。肿瘤的定义就是体内异常细胞的不受控制的生长,诱发肿瘤的机制一般是遗传物质的缺失、扩增或突变。APE1不仅能够作为遗传学标志,而且还可以成为靶向的分子。肿瘤细胞中APE1通常是过度表达的,APE1能够促进肿瘤细胞的生存,也促进肿瘤对化疗和放疗的抵抗。APE1的表达异常已经被证实与多种肿瘤相关,而且内切酶活性还与肿瘤分级呈正相关。通过APE1si RNA(small interfering RNA)下调肿瘤细胞的APE1的表达,发现APE1对肿瘤发生发展有重要作用。下调APE1能够增强许多肿瘤对化疗药物的敏感性。本课题组在前期的研究中已经证实:①APE1的蛋白水平和亚细胞定位与卵巢癌的发生、铂类药物敏感性和临床预后相关;②APE1在卵巢癌敏感株和耐药株中存在表达差异,耐药株中的蛋白水平明显高于敏感株;③上调APE1能显著降低卵巢癌细胞对铂类的敏感性;④APE1的氧化还原功能对卵巢癌铂类耐药具有重要作用,并且参与了肿瘤的增殖。尽管对APE1在卵巢癌的发生发展所发挥的作用的研究已经取得了一些成果,但许多问题仍未得到圆满的解答。APE1虽然参与了卵巢癌的铂类耐药,但其具体机制如何?对APE1参与铂类耐药的具体机制的研究能够为卵巢癌的临床治疗提供新的思路。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是细胞内的重要的信息传递通路,参与了细胞的生长、分化、生存和免疫反应等多个生理过程。哺乳动物的MAPK家族包括:细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、细胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38通路。研究发现在肿瘤细胞中MAPK通路常常表现功能失调。多个研究证实MAPK通路参与了肿瘤发生、血管生成、化疗耐药等多个过程。那么MAPK通路和APE1是否都参与了卵巢癌的铂类耐药呢?MAPK通路和APE1的关系又是如何呢?根据前期的研究工作,我们设计了下述研究方案:(1).通过流式细胞术检测探讨顺铂对卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;(2).将A2780细胞和A2780/DDP细胞分别转染APE1 pc DNA3.1和APE1 si RNA片段,观察APE1表达水平对细胞内ROS水平的影响;(3).Western blot检测顺铂对卵巢癌细胞内APE1表达及MAPK通路相关蛋白的影响;(4).MTT法检测MAPK各通路抑制剂对顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的影响;(5).通过N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)和H2O2干预细胞内ROS水平,观察ROS水平对顺铂调控MAPK通路活性的影响;(6).通过Western blot方法,从蛋白水平检测改变细胞内APE1表达对MAPK通路活性的影响;(7).Hoechst 33258染色和流式细胞术检测ROS水平、APE1表达对顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的影响;(8).Western blot检测APE1表达和ROS水平对p38 MAPK通路活性和凋亡通路相关因子的影响;(9).通过流式细胞术检测细胞周期,观察顺铂、APE1和p38 MAPK通路对细胞周期的影响。(10).构建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,观察APE1与MAPK通路抑制剂对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。通过上述实验,我们得到了以下结果:(1).顺铂作用于卵巢癌细胞后,能够显著增加细胞内ROS水平,2小时后ROS水平达到峰值,并维持峰值至24h,48h后ROS水平下降;A2780/DDP中ROS水平低于A2780水平。(2).通过转染APE1 pc DNA3.1和APE1 si RNA片段,发现上调APE1表达能够降低顺铂刺激细胞所引起的ROS水平的升高,而下调APE1表达使细胞内ROS水平升高,APE1对细胞内ROS水平有调控作用。(3).通过NAC与H2O2干预细胞内ROS水平,证实顺铂通过ROS调控MAPK通路的活性。NAC能够抑制顺铂所诱导的卵巢癌细胞的凋亡,而H2O2与顺铂协同促进了卵巢癌细胞的凋亡。(4).顺铂作用于卵巢癌细胞后,通过ROS激活细胞内MAPK通路。(5).MTT法检测结果表明p38 MAPK通路抑制剂SB203580能够减弱细胞对顺铂的敏感性,ERK抑制剂与JNK抑制剂能够增加细胞对顺铂的敏感性。(6).通过改变卵巢癌细胞内APE1的表达,并干预细胞内ROS水平,发现APE1可通过调控ROS水平进而影响p38 MAPK的活性。(7).Hoechst 33258染色和流式细胞术检测结果表明NAC能够抑制顺铂所诱导的卵巢癌细胞的凋亡,而H2O2与顺铂协同促进了卵巢癌细胞的凋亡,提示顺铂通过ROS影响细胞凋亡。而APE1也通过调控ROS水平影响顺铂诱导的细胞凋亡。(8).顺铂能够促进Cyt C的释放,激活Caspase家族,Caspase-3与Caspase-9剪切体水平上调。上调APE1表达能够通过降低ROS水平抑制p38 MAPK的活性,从而减少了凋亡通路相关因子的表达。(9).顺铂刺激能够使卵巢癌细胞发生G1期阻滞,上调APE1与抑制p38 MAPK的活性能减少G1期比例,细胞增殖指数增加。(10).成功构建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,在活体中验证了APE1与p38MAPK通路对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。综上所述,我们在前期工作的基础上,通过对A2780和A2780/DDP细胞内APE1表达与MAPK通路的相关性进行了进一步研究,发现卵巢癌细胞中ROS水平的改变与MAPK通路的活性呈正相关。顺铂能够通过ROS影响MAPK的活性。而且利用已构建好的APE1 pc DNA3.1质粒和APE1 si RNA片段改变卵巢癌细胞中APE1的表达水平,发现APE1的表达对卵巢癌细胞内的ROS水平起着调控作用,而ROS水平又与MAPK通路的活性相关。进一步说明了ROS、MAPK通路与APE1表达之间的关系。顺铂敏感细胞株A2780中的p38 MAPK活性较顺铂耐药细胞株A2780/DDP中的活性增加,而抑制p38 MAPK通路减少了顺铂诱导的细胞凋亡效应,说明p38 MAPK的活性在顺铂耐药机制中发挥了重要作用。为卵巢癌顺铂耐药机制的研究提供了新的证据。在体内实验中也验证了这一现象,为逆转卵巢癌的铂类耐药提供了新的思路。