论文部分内容阅读
细胞毒性T细胞(CTL)为CD8+T细胞,通过识别抗原肽/MHC I类分子复合物(pMHC)来特异性杀伤靶细胞,在肿瘤免疫中发挥重要作用。然而肿瘤细胞表面往往缺乏免疫原性强的抗原表位,且肿瘤变异后低表达或不表达MHC分子,限制了T细胞介导的抗肿瘤免疫效应。转铁蛋白受体(TfR,CD71)在细胞恶变时大量表达,与肿瘤的发生和发展密切相关,被认为是肿瘤细胞相对特异性的标志。本论文利用针对转铁蛋白受体的单链抗体(TfRscFv)能结合肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体的特点,制备抗原肽/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白(抗原肽/HLA-A2复合物与转铁蛋白受体单链抗体融合蛋白,简称为融合蛋白),通过其TfRscFv靶向表达TfR的肿瘤细胞,从而将特异性CTL识别的抗原肽/HLA-A2复合物结合到的肿瘤细胞表面,利用机体高效的病毒特异性 T细胞应答来杀伤肿瘤细胞,为肿瘤的免疫治疗拓展新的思路。论文共分为三部分,其主要内容与结果如下: 一、HLA-A2/TfRscFv融合基因的构建、表达及鉴定 构建HLA-A2/TfRscFv融合基因的表达载体HLA-A2/TfRscFv-pET28 a(+),经诱导表达获取包涵体蛋白后与β2m及HLA-A2限制性的EB病毒抗原肽GLC280–288或HBV病毒抗原肽HBcAg18-27在体外复性、折叠,分别形成EBV/HLA-A2/TfRscFv(EBV病毒抗原肽与 HLA-A2/TfRscFv包涵体蛋白及β2m折叠产物)或HBC/HLA-A2/TfRscFv(HBC病毒抗原肽与HLA-A2/TfRscFv包涵体蛋白及β2m折叠产物)融合蛋白。Western blot与ELISA证实该融合蛋白制备成功,而且具有正确的HLA-A2分子空间构像。为下面研究融合蛋白介导的病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞的作用奠定了物质基础。 二、融合蛋白介导病毒特异性CTL在体外杀伤肿瘤细胞 已构建的融合蛋白中,其TfRscFv能够结合肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体,从而将病毒肽/HLA-A2复合物结合在肿瘤细胞表面,将介导病毒特异性CTL识别和杀伤肿瘤细胞。结果显示 EBV/HLA-A2/TfRscFv、HBC/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白可结合于肿瘤细胞(K562、HepG2、U937)表面,结合率均在25％左右。通过加载病毒肽的T2细胞在体外诱导产生病毒抗原特异性的CTL,病毒抗原特异性CTL能有效杀伤结合有融合蛋白的肿瘤细胞,效靶比为40:1时的有效杀伤率约为50%,明显高于不加融合蛋白的空白对照组(约10%)和过继非特异性CTL的阴性对照组(约15%)。证明EBV/HLA-A2/TfRscFv、HBC/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白能在体外介导病毒特异性T细胞杀伤肿瘤细胞。 三、融合蛋白介导荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长抑制初探 由于裸鼠的免疫缺陷,在一定情况下,不排斥来自异种动物的组织移植,因此,本研究将其作为人类肿瘤细胞的受者,在荷瘤的裸鼠体内观察融合蛋白介导病毒抗原特异性CTL对肿瘤生长的抑制作用,为融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的应用提供动物实验依据。1×106 K562接种于裸鼠,随机分为三组,特异性干预组为过继EBV/HLA-A2/TfRscF融合蛋白和EBV特异性CTL,非特异性干预组为过继EBV/HLA-A2/TfRscF融合蛋白和HIV特异性CTL,无干预组仅注射PBS。结果显示特异性干预组成瘤率明显低于非特异性干预组及无干预组(22.2%vs88.9%,100%,P<0.001);特异性干预组存活率及生存时间明显大于非特异性干预组(75%vs25%和54天vs38天,P=0.031)及无干预组(75%vs0%和54天vs31天,P=0.006)。说明融合蛋白可以介导的荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长抑制,延长实验小鼠的生存时间、提高其生存率。