干旱导致日趋严重的土壤荒漠化和作物减产，严重地威胁人类未来的生存环境和食物供给。据不完全统计，全球荒漠化面积已占陆地面积的25﹪，我国干旱半干旱地区占国土面积52.5﹪，而且有逐年加剧的趋势，引起了人们的广泛关注。培育抗旱耐旱植物是确保人类未来拥有优良生存环境和食物供给的关键。分子生物学的迅猛发展，使基因工程技术成为目前培育抗旱耐旱植物最为快捷和有效的途径之一。而目的功能基因的克隆和抗旱机理的研究则是利用基因工程技术改良作物的前提。 为此，本研究基于分子生物学研究模式植物拟南芥的丰富信息积累，选择抗逆性(抗干旱和低温)优于拟南芥，而又同为十字花科的实用园艺植物羽衣甘蓝(Brassicaoleraceavar.acephalaLinn，)为研究材料，拟克隆其体内与抗逆过程相关的基因，并通过分子生物学方法对所克隆的基因进行表达分析和功能验证，旨在为改良农作物抗逆性提供更为高效的候选基因。 本研究依据拟南芥脱水响应基因rd29及油菜中拼接的EST同源序列设计简并引物，以干旱诱导的羽衣甘蓝幼叶的基因组cDNA和DNA为模板，分别利用cDNA末端快速扩增(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)和PCR技术，首次成功地从羽衣甘蓝中克隆了一个脱水响应基因BoRS1(stress-responsive)的cDNA全长序列和基因组全长序列。结果表明，BoRS1的cDNA全长为2，076bp(GenBankAcc.No.AY373021)，其中开放读码框ORF长1，851bp，编码617个氨基酸残基；基因组全长为2，225bp，有4个内含子和5个外显子。通过GenBank数据库的BlastSearch(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对分析，结果表明，BoRS1基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列与拟南芥中lti65、rd29B、rd29A和lti140等脱水响应基因有一定的相似性。在蛋白质水平上，BoRS1推导蛋白分别与lti65，RD29B，RD29A和lti140表现出41.7﹪，38.7﹪，36.4﹪和21.8﹪的一致性。通过信号肽预测软件(http：//www.cbs.dtu.uk/services/signalP)及蛋白质分析软件(http：//us.expasy.org/tools/protscale.html)对其二级结构进行分析，结果显示，BoRS1推导蛋白具有较高亲水性(79﹪)、高无规线圈成分(62﹪)、高比例的谷氨酸(15﹪)和甘氨酸(11﹪)组成，而缺乏半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸残基，这些特征与拟南芥脱水响应蛋白RD29A、RD29B及LEA蛋白相似。据此可以推测，BoRS1推导蛋白与RD29蛋白和LEA蛋白在水分胁迫中具有相似功能。 Southernblot分析表明，BoRS1基因属多基因家族，在羽衣甘蓝基因组中有2个拷贝。在逆境胁迫下，通过Northernblot和半定量一步PCR技术分析了BoRS1基因在不同器官以及不同羽衣甘蓝品种中的表达模式。结果表明，BoRS1基因在mRNA转录水平能被干旱、盐、冷和外源ABA等逆境胁迫条件所诱导，是一个广义的逆境胁迫响应基因。而且在逆境胁迫条件下诱导表现为非组织特异性，在充分水合化的营养器官(根、茎、叶)中均有表达，并且在干燥种子中也检测到了该基因的微弱表达。BoRS1的ABA诱导表达可能分为两步，两次表达高峰的产生可能是通过一个反馈抑制机制实现。而在低温、干旱及高盐胁迫下的表达均为一步诱导过程。同时，通过对不同抗性羽甘蓝品种中BoRS1的表达模式分析，干旱胁迫下该基因的表达在不同品种中存在差异，抗性强的品种BoRS1基因的表达要强于抗性较弱的品种，这一结果进一步揭示其可能在干旱胁迫中发挥作用。 通过BoRS1表达模式的分析，可以初步证实BoRS1基因是响应于ABA的，并且推测该基因存在于干旱胁迫及冷胁迫共同作用的信号传导途径中。结果还显示，尽管BoRS1表达模式与rd29A、rd29B有一定相似性，但在基因表达启动的时间、表达过程及表达量上均存在着一定差异。同时，鉴于BoRS1在干旱和冷胁迫下应答敏感，而在高盐胁迫下应答不敏感，笔者认为该基因的功能是通过渗透压的改变使植物细胞产生响应，而不是通过离子区域化来实现的。 为了鉴定从羽衣甘蓝中克隆的BoRS1基因的生物学作用，构建了植物双元表达载体p2300+BoRS1，采用冻融法导入农杆菌EHA105，通过农杆菌介导法转化烟草(Nicotianatabacumvar.PetitHavanaSR1)叶盘。所获得的130株卡那抗性植株中有36株是PCR阳性苗，转化率为27.7﹪。对部分PCR阳性苗进一步进行Southernblot分析，结果表明外源BoRS1基因在独立的转基因烟草基因组中的拷贝数为1-3个，说明BoRS1基因已经成功地整合到部分转基因烟草植株基因组中。半定量一步PCR结果显示，BoRS1基因在不同T0代转基因烟草表达量存在着差异。对能够表达BoRS1基因的4个转基因烟草株系的T1代分离分析表明，BoRS1基因在转基因烟草T1代均产生了分离，分离比基本符合3：1。 为了进一步探讨BoRS1表达对转基因烟草在环境胁迫条件下的生物学功能，研究了干旱胁迫下超量表达BoRS1的转基因烟草外部形态和逆境的耐受性。结果表明，正常生长条件下，转基因烟草在生长速度和农艺性状上与非转基因烟草没有明显差别。与未转化对照相比，转基因植株离体叶片的失水速率较慢。在干旱胁迫下，尽管不同转基因烟草株系在发芽率方面存在差异，但转基因烟草T1代种子发芽率显著高于野生型植株，表明转基因烟草比野生型烟草具有更强的耐旱性。同时，转基因烟草积累的干物质显著多于对照，而相对含水量没有显著差异，说明转基因烟草植株在干旱胁迫条件下，在不牺牲植株体内的相对含水量的基础上保持较为良好的生长状况是由于积累了更多的干物质。表达BoRS1基因的烟草叶中总叶绿素的含量也显著高于非转基因对照植株，在一定程度上说明了转BoRS1基因烟草抗干旱能力的增强是由于基因产物的表达减少了叶绿体、叶绿素受破坏的程度。而且不同的转基因株系之间对环境胁迫的耐受力与BoRS1的表达量并不存在线性关系，可能是该基因对植物的作用有一个阈值。