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现在越来越多的实验证实褪黑素具有抗炎效果,能显著降低炎症性损伤,但其抗炎分子机制尚不清楚。本研究从调控炎症介质基因表达的细胞内信号转导通路,探讨褪黑素(MT)抑制LPS所致细胞因子表达的机制。采用MT预先给药进行干预,然后用LPS刺激RAW264.7细胞,通过比较细胞中炎性基因的表达变化及其介导的下游信号分子改变,探讨MT抑制LPS所致的细胞中炎性基因表达的分子机制。结果显示,LPS处理RAW264.7细胞2h后即能上调RAW264.7细胞肿瘤坏死因子-alpha (TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、IL-8mRNA的转录水平。直至6h这些细胞因子转录水平仍维持在较高状态。在刺激期内,IL-17和IFN-y转录水平未见明显变化。MT在LPS感染RAW264.7细胞2h后,即可下调LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8mRNA的转录水平。LPS处理2h后,抗炎因子IL-10转录水平明显上调,IL-4转录水平未见明显变化。MT下调了LPS诱导的IL-10转录水平。MT对LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达研究表明,LPS处理RAW264.7细胞2h后,大幅地上调了iNOS的转录水平,直至6hiNOS转录还维持在较高水平。MT明显下调了LPS诱导的iNOS mRNA的转录,相应MT明显抑制LPS所致的iNOS蛋白的升高。接着分析了MT对LPS诱导的环氧酶(COX-2)的影响,LPS处理RAW264.7细胞2h后,轻度地上调COX-2的转录水平;进一步的分析表明LPS处理RAW264.7细胞6h后,COX-2的转录水平明显上调。MT短期内下调了LPS诱导的COX-2mRNA的转录,MT基本上抑制LPS诱导的COX-2蛋白的表达。为了研究MT对LPS诱导的MAPK信号通路的影响,用Western blot检测RAW264.7细胞中磷酸化的c-Jun N-末端激酶(pJNK). pp38和磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)的表达。pJNK、pp38和pERK的蛋白水平随着LPS处理时间的延长而增加,在30min时达到最高峰。但是,MT没有抑制LPS诱导的JNK、 p38和ERK的磷酸化。相反,MT单独处理还小幅上调RAW264.7细胞中JNK、p38和ERK的磷酸化水平。为了检测MT对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB活性的影响,用Western blot检测RAW264.7细胞中NF-κB的抑制蛋白IκB和核蛋白NF-κB p65和p50蛋白含量,LPS明显下调细胞中IκB的蛋白含量,上调细胞中NF-κB p65和p50的含量。MT预处理显著抑制IKB蛋白的降解,从而减少活化NF-κB p65和p50的含量。接着分析MT对LPS诱导的RAW264.7细胞中AKT磷酸化的影响。结果显示LPS和MT都没有影响AKT蛋白的表达。但LPS处理上调了AKT蛋白的磷酸化水平,MT极显著地抑制了LPS所致AKT蛋白的磷酸化。然后又检测了MT对LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4和MyD88的影响。试验结果显示单独用LPS处理理RAW264.7细胞,LPS对TLR4的转录没有影响。但是在MT干扰组中,在LPS处理6h后,MT小幅上调TLR4的转录水平。用Western blot检测MyD88蛋白的表达变化,MT对LPS处理2h的细胞中MyD88蛋白的表达几乎没有影响,但是MT显著下调LPS处理6h的细胞中MyD88蛋白的表达。最后分析了MT对LPS诱导的RAW264.7细胞中干扰素调节因子3(IRF3)、IRF7和β干扰素(IFN-p)转录表达的影响。LPS处理6h, RAW264.7细胞中IRF7和IFN-β的转录水平大幅提高,而IRF3的转录几乎没有影响。MT大幅下调LPS诱导的IRF7和IFN-β的转录水平。本研究证实褪黑素能够抑制巨噬细胞中TLR4信号通路中炎性基因的表达。除此之外,褪黑素也减弱了巨噬细胞中TLR4介导的NF-κB和AKT的活性。我们还有个重要的发现,在LPS刺激的巨噬细胞中,褪黑素不仅抑制了MyD88依赖信号通路中的关键接头分子MyD88的表达,同时也抑制了Toll样受体相关的干扰素活化子(TRIF)依赖信号通路中的IRF7mRNA的转录表达。实验结果表明,褪黑素通过MyD88依赖的和TRIF依赖的两条信号通路调节TLR4介导的炎性基因的表达。