论文部分内容阅读
背景及目的:通过基因芯片筛选研究和后续的免疫印迹验证实验发现,经过2-8Gy电离辐射和/或适当剂量紫杉醇作用后,人口腔上皮癌KB细胞的SPATA5L1表达明显增高。在肿瘤细胞中该基因的功能目前尚未有任何报道。本课题旨在通过构建该基因的过表达质粒并稳定转染KB细胞,同时应用多种检测肿瘤细胞生物学特点的实验方法,对SPATA5L1基因的功能进行初步探究,探讨肿瘤治疗后容易转移和复发的可能分子机制,以寻找新的肿瘤诊断、治疗分子靶点。方法:1、采用脂质体转染法将SPATA5L1基因转入口腔癌细胞,经G418筛选,挑取阳性克隆;用Real-time PCR和Western blot方法检测SPATA5L1基因的mRNA表达和蛋白表达。2、将稳定转染SPATA5L1基因的细胞作为实验组,转染空质粒的细胞作为对照组,不转染的细胞作为空白组。采用CCK-8法检测细胞的增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡; Western blot法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白的表达变化。3、采用划痕实验和Transwell小室法观察细胞的体外迁移能力;光学显微镜和扫描电镜观察细胞的形态变化特别是伪足变化; Western blot法检测相关蛋白的表达变化。结果:1、成功构建pEX-1-SPATA5L1表达载体并转染至KB细胞,经过G418压力筛选所得到的稳定表达细胞株,在转录水平和蛋白水平均检测到目的基因SPATA5L1的高表达。2、转染并高表达SPATA5L1基因的KB细胞的增殖能力明显高于对照组细胞和空白组细胞,且S期细胞比例升高,与细胞周期有关蛋白CyclinD1表达增加,CyclinB2表达未变。3、转染并高表达SPATA5L1基因的KB细胞S凋亡率明显低于两种对照细胞,且细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显升高,促凋亡蛋白Bax表达未变。4、与对照组和空白组细胞比较,转染并高表达SPATA5L1基因的KB细胞体外迁移能力明显增加。细胞形态变为长条梭形,且细胞表面丝状伪足的数量明显增加,同时与细胞迁移能力有关蛋白Cdc42表达明显增加。结论:成功构建pEX-1-SPATA5L1表达载体,被成功转染并高表达的SPATA5L1蛋白可促进肿瘤KB细胞增殖,降低细胞凋亡率,提高S期细胞比例,并使细胞丝状伪足增多,提高其转移迁移的能力。SPATA5L1可能是一种特殊的反应蛋白,是有关肿瘤放射或/和化学治疗后易于复发和转移机制的重要分子之一,也是未来肿瘤诊断和治疗的重要分子靶点。