肠出血性大肠杆菌（EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC）是具有一般大肠杆菌形态特征、革兰氏阴性、无芽孢的直杆菌。EHEC是动物传染性肠道病原，在世界范围造成散发。EHEC定植于肠道，产生志贺毒素，造成腹泻，并可引发出血性结肠炎及出血性尿毒综合症，儿童和老人最易感。自美国1982年首次爆发并确定为病原以来，世界上许多国家均相继发生过EHEC感染的流行，现今其感染已成为一个全球性的公共卫生问题。目前仍无有效治疗 EHEC感染的方法。因为抗生素治疗会大大增加溶血性尿毒综合征的发病率，国家卫生部禁止使用抗生素对EHEC感染或疑似感染患者进行治疗。深入理解 EHEC致病机理可为预防和治疗EHEC感染提供线索。　　EHEC进入肠道后，粘附于派伊尔氏结（Peyers patch）处的滤泡相关上皮细胞和回肠末端肠绒毛。EHEC可被肠道 M细胞摄入，并转移给肠道巨噬细胞。EHEC可在巨噬细胞内复制，并合成大量志贺毒素。释放的志贺毒素具有细胞毒性、肠毒性和神经毒性。EHEC还利用III型分泌系统将细菌编码的效应蛋白转运到真核细胞中，通过III型分泌系统进入到宿主细胞中的效应蛋白能够通过非常精细的调控，来操纵细胞内的生物学过程，从而有效的逃逸宿主细胞的防御反应。　　由此可见，EHEC致病过程中，志贺毒素和经III型分泌系统进入宿主细胞的效应蛋白发挥着重要作用。对经III型分泌系统进入宿主细胞发挥作用的EHEC效应蛋白的研究将有助于揭示 EHEC的致病机理。Toru等人利用生物信息学方法预测了一系列潜在的经III型分泌系统进入宿主细胞的效应蛋白，分别命名为EspK、EspL、EspM、EspN、EspO、EspR等。这些预测方法缺乏确凿的证据，我们首要的工作是通过实验方法确认 EspN是 III型分泌系统的效应因子，进一步探讨EspN在EHEC感染损伤中是否行使功能。　　一、在细菌感染时EspN通过III型分泌系统进入宿主细胞　　本实验利用PCR技术从EHEC O157:H7EDL933全基因组中扩增了espN基因，将其扩增到 TEM基因上游，构建成融合质粒 espN-TEM-pET-28a，利用电穿孔技术分别将其转入EHEC O157:H7 EDL933野生株（wild type，WT）和三型分泌系统缺失株中（ΔescN::EHEC），构建了espN-TEM/WT和espN-TEM/ΔescN，在系统中选择已知的EHEC三型分泌系统效应蛋白Map作为考察 TEM报告系统的阳性对照。结果证实了在WT株中 EspN蛋白同Map蛋白都通过III分泌系统进入细胞，伴随目的基因进入宿主细胞的TEM基因表达产物切割了CCF2-AM底物,由原本发射绿色荧光改为发射蓝色荧光；在ΔescN株中EspN蛋白与Map蛋白都不能通过三型分泌系统进入宿主细胞，Merge后的图片CCF2-AM本身激发的绿色荧光占主导，这表明了espN基因编码的EspN蛋白能够通过EHEC的三型分泌系统进入宿主细胞。　　二、EspN蛋白参与EHEC的感染损伤　　为了进一步探讨EHEC O157：H7效应蛋白EspN的功能和致病机制，利用λRed重组法构建了espN基因缺失株ΔespN::EHEC（以下简称ΔespN）。在LB培养基中分别培养ΔespN与WT，发现两者在LB培养基中的生长速度无明显变化，这表明缺失espN基因不影响EHEC自身的生长特性。在ΔespN菌株的基础上转入espN-pACYC184质粒，构建了缺失株的回补株ΔespN/espN。接着以HT-29细胞为模型，MOI=1：100感染细胞2、4、6h，利用平板计数法测定粘附到细胞上的菌落数量，发现随着感染时间增加各组细菌粘附在细胞上的数量都递增，但是ΔespN与WT相比在各个感染时间点均无显著差异，这表明EspN效应蛋白不影响细胞的粘附作用。为了进一步在体内水平确定EspN效应蛋白不影响细胞的粘附作用，我们在菌株感染小鼠后，检测菌株在结肠中的定殖量以及在粪便中的排菌量，结果显示，ΔespN在结肠中的定殖量与粪便中的排菌量都与 WT和ΔespN/espN无异，进一步说明了EspN效应蛋白不影响细胞的粘附作用。　　用前述三种菌株分别感染小鼠后，ΔespN感染导致小鼠致死率较WT感染下降了50％，较ΔespN/espN感染下降了30%，这表明缺失espN基因后对小鼠具有保护作用，而在espN基因存在的情况下有利于EHEC感染损伤小鼠。缺失株和回补株在小鼠致死率上有显著差异，我们进一步考察缺失espN基因后在感染小鼠过程中对小鼠器官的损伤是否存在差异，我们选取了 EHEC常见的损伤器官结肠和肾脏，制备成组织纵切片以观察肾脏和结肠病变情况，结果显示在结肠组织中野生株感染造成的损伤较突变株严重（P=0.016），在肾脏组织中野生株感染造成的损伤较突变株严重（P=0.003）。　　用前述三种菌株分别感染小鼠后，通过 ELISA检测血清和结肠组织液中相关细胞因子表达量，发现所有细胞因子在小鼠血清中的表达量均高于结肠组织液中的表达量，其中在血清中检测到细胞因子 IL-1β和志贺毒素在 WT和ΔespN/espN感染后的表达量显著高于ΔespN感染后的表达量（P＜0.01）。　　三、EspN效应蛋白与巨噬细胞的相互作用　　利用WT、ΔespN、ΔespN/espN分别感染巨噬细胞THP-1后，检测培养上清中IL-1β表达量，细胞裂解液中志贺毒素表达量。结果发现PMA刺激后的THP-1经 WT株感染后比ΔespN株感染后表达更高水平的IL-1β和志贺毒素，回补espN基因后 IL-1β和志贺毒素的表达又恢复到 WT株水平。上述三种菌株分别感染经PMA刺激后的THP-1细胞2h，加入庆大霉素处死胞外细菌，换入新鲜培养基继续分别培养2h、24h，比较在2h时不同菌株感染的巨噬细胞包吞EHEC的能力，以及在24h时EHEC在巨噬细胞内存活和增殖情况。结果显示，WT株感染的巨噬细胞包吞 EHEC的能力显著高于ΔespN(P＜0.0001)，ΔespN/espN株感染的巨噬细胞包吞EHEC的能力显著高于ΔespN(P＜0.0001)。继续培养在24h时，WT、ΔespN、ΔespN/espN在巨噬细胞内的存活和增殖相比2h时无显著性差异(P＞0.05，24h vs2h)。　　综合全文得出结论：经过T3SS分泌系统进入真核细胞的EspN效应蛋白是non-LEE毒力岛上基因编码的效应因子，不同于大多数 LEE毒力岛上的效应因子，EspN不影响细菌的粘附作用，缺失espN基因后的菌株与WT相比在粘附能力上不存在差别。细胞水平实验进一步证实，EspN蛋白可以活化巨噬细胞THP-1高表达IL-1β，增强巨噬细胞包吞EHEC的能力（而非影响在巨噬细胞内细菌存活和增殖能力），导致志贺毒素表达量升高。从而在动物水平上观察到，EspN蛋白存在时导致感染小鼠时血清中 IL-1β和志贺毒素表达量升高，EspN缺失会导致感染致死率明显降低，这提示我们EspN参与了感染损伤的重要环节。