论文部分内容阅读
水稻白叶枯病是由水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）引起的世界水稻生产上重要的细菌病害之一，其致病性及其调控机理的解析将有助于病害的有效控制。由于经济上的重要性以及遗传可操作性，水稻-Xoo的互作已经成为植物-病原物分子互作的研究模式系统之一。随着KACC10331、MAFF311018、PXO99A3个菌株全基因组测序工作的陆续完成，为深入研究Xoo的致病分子机理奠定了基础。c-di-GMP是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使，调控着毒性、生物膜形成、运动性等诸多方面的生物学功能。GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶（DGC）控制c-di-GMP的合成，而EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）控制其降解，这些蛋白在很多细菌的基因组中广泛存在，形成一个复杂的调控网络。通过生物信息学分析发现，在Xoo中存在26个c-di-GMP代谢相关蛋白;研究发现，其中PdeR、RpfG、VieA等基因参与调控Xoo EPS产生和致病性等生物学过程。然而，对于c-di-GMP信号系统在Xoo中的上下游调控体系及作用机理等还未知。本研究旨在更深一步揭示Xoo c-di-GMP信号途径，为进一步解析Xoo的致病分子机理提供科学依据。1.双组份调控系统PdeK/PdeR调控c-di-GMP的代谢和Xoo毒性双组份调控系统是细菌中主要的感应-调节机制，典型的TCS包括组氨酸激酶（HK）和反应调控蛋白（RR），对感应外界的信号和调控细胞功能起到了关键的作用，其中一类RR包含c-di-GMP信号相关结构域作为输出结构域，接受来自上游的磷酸化信号后激活其活性。PdeR（PXO01019）是带有c-di-GMP代谢相关结构域GGDEF，EAL及磷酸化信号接收结构域REC的RR，调控EPS产生和致病性，在其两侧具有两个组氨酸激酶蛋白PdeK（PXO01018）和PXO01020。为了对PdeR的功能更深入的了解，首先原核表达了PdeR全长和不同结构域蛋白，显色法和HPLC分析包含GGDEF和EAL结构域的PdeRGE具有的PDE活性。采用同源重组的方法，构建了PdeK和PXO01020的突变体，发现与野生型相比，PdeK缺失突变后致病性明显的降低， PdeK胞外多糖的产生也有所减少，但是PXO01020相对于野生型表型没有明显的变化。RT-qPCR结果显示，在PdeR与PdeK中EPS合成相关各基因gumMBKD和T3SS系统的相关基因hrpG，hrpX和hpa1的表达表达明显降低了，说明这些基因受PdeR和PdeK正调控。在酵母双杂交试验中，发现PdeR与PdeK具有较强的相互作用，这种作用依赖于PdeR的REC和EAL结构域，而PdeR与PXO01020没有发现互作；当PdeK蛋白磷酸化后，与PdeR进行反应，激活了PdeR全长蛋白的PDE活性。总之，PdeK （HK）/PdeR（RR）组成一对双组分系统、调控c-di-GMP的代谢和水稻白叶枯病菌的毒性。2. c-di-GMP受体蛋白PXO00403调控Xoo毒性和HRc-di-GMP受体作为c-di-GMP信号的下游调控机制，与c-di-GMP直接结合或调控下游目标基因的表达，从而调控细胞功能。PliZ结构域蛋白、转录调控因子FleQ和Clp、mRNA生物开关等可以与c-di-GMP结合，此外一些退化的GGDEF或EAL也作为c-di-GMP受体发挥功能。这些受体的存在说明c-di-GMP在基因转录、翻译和翻译后不同的水平调控细菌细胞的生物过程。 PXO00403，包含c-di-GMP代谢相关结构域GGDEF和EAL，PXO00403突变后Xoo致病力明显的下降，而且在非寄主烟草上引起的过敏性反应有所延迟。RT-qPCR分析T3SS相关基因hrpG，hrpX和hpa1在PXO00403中成下调表达。通过生物信息学分析、酶活试验和ITC试验发现，PXO00403的GGDEF结构域和EAL结构域退化并不具有活性，而是与c-di-GMP以1:1比例结合，说明PXO00403在Xoo中以c-di-GMP受体来调控细菌的致病性和HR。3. GGDEF结构域蛋白PXO00649和PXO02615功能鉴定PXO02615和PXO00649只包含c-di-GMP合成相关结构域GGDEF，本研究对PXO02615和PXO00649基因的功能进行了初步的研究。采用标记置换法构建了基因突变体，发现PXO02615突变后EPS产生较野生型增加了20%，PXO00649突变后，EPS产生及致病力有一定程度的增强，而运动性、生物膜、胞外酶等没有变化。结果说明，PXO02615和PXO00649参与调控了Xoo的致病性和EPS的产生，对于PXO02615和PXO00649是否是通过影响c-di-GMP的浓度而发挥作用，需要进一步研究。总之，本研究揭示了水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号途径的上游受磷酸化信号的影响，下游通过与受体分子的结合，调控毒性基因的表达从而影响毒性，为进一步了解c-di-GMP调控网络及Xoo的致病机理提供了科学依据。