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背景食管癌(Esophageal cancer,EC)发病率和死亡率分别居全球所有癌症发病率和死亡率的第八位和第六位。中国每年EC新增及死亡患者居世界首位,食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有EC 90%以上。近几十年来,ESCC多学科综合治疗取得了巨大进展,但ESCC预后差,外科根治性手术后五年生存率仍低于30%。ESCC预后差的主要原因是首次确诊的ESCC时已发展至疾病的中晚期,并且50%的病人已发生远处转移。TAGLN2(Transgelin2,转凝蛋白)属Calponin家族成员之一,是平滑肌22alpha(Smooth muscle 22alpha,SM-22α)的同源蛋白,TAGLN2蛋白参与细胞应力纤维构成,与肌动蛋白相互作用维持其稳定性。研究表明TAGLN2在肺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈鳞状细胞癌及头颈鳞状细胞癌中高表达,但在乳腺癌、肝细胞癌及食管腺癌中常低表达。Hippo信号通路是肿瘤抑制性通路之一,该通路失活能够导致Hippo信号通路主要靶分子YAP、TAZ的活性升高,进一步促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭。本研究分析了TAGLN2、YAP和TAZ在ESCC中的表达相关性,深入理解TAGLN2与ESCC临床病理特征的相关性及在ESCC发生、演进中的作用。目的分析TAGLN2在正常食管上皮细胞组织(Normal esophageal epithelium,NEE),低级别上皮内瘤变组织(Low grade intraepithelial neoplasia,LGIN),高级别上皮内瘤变组织(High grade intraepithelial neoplasia,HGIN)及不同TNM分期的ESCC组织中的表达特征,阐明TAGLN2表达变异与ESCC患者的临床病理指标的相关性及与ESCC根治性切除手术后整体生存率的关系,明确TAGLN2在ESCC发生及演进中的作用;并分析TAGLN2与YAP、TAZ在ESCC中的表达相关性。1材料与方法1.1实验细胞及组织食管上皮永生化细胞NEC、NE6及ESCC细胞系NE3、EC1、TE1、EC9706均来自河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室;100例TNM I-IV期患者ESCC及对应癌旁组织(每期25例)均来自林州市肿瘤医院病理科2010年-2012年底收集的组织样本;162例五年随访ESCC术后患者,86例购自上海芯超组织芯片公司,另76例来自河南大学附属医院淮河医院2007年-2012年随访的ESCC患者,所有ESCC患者术前未接受任何化学治疗或放射治疗。1.2实验方法1.2.1 RT-PCR分别提取ESCC各期及对应癌旁组织mRNA,每期25对,测mRNA浓度,反转录采用Promega A3800 Im Prom‐II?Reverse Transcription试剂盒进行,反应体系为20 ul,包括Mg Cl2、5×buffer、引物、RNA酶抑制剂、反转录酶,在全自动扩增仪上将mRNA反转录成c DNA;配制RT-PCR反应体系20 ul,包括2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)、引物、DEPC水及c DNA,95℃解链、58℃退火、72℃延伸,定量检测TAGLN2 mRNA在ESCC TNM各期组织及癌旁组织中的差异表达。1.2.2 Western blot所有组织及细胞均用2D裂解液提取蛋白,包括癌前病变各期组织蛋白(NEE、LGIN、HGIN各5例),ESCC(Ⅰ-Ⅳ期)及对应癌旁组织各25对。细胞包括NEC、NE6、EC1、TE1、NE3、EC9706细胞系,Bradford法检测蛋白浓度。每孔30μg蛋白在SDS-PAGE中电泳分离各分子量蛋白。将蛋白转印至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,一抗按抗体推荐浓度TBST稀释,4℃孵育过夜,二抗按推荐浓度TBST稀释配制,室温平摇1h,加增强型ECL发光剂曝片检测目的条带,Western blot结果半定量分析采用Quantity One软件进行。1.2.3免疫组织化学染色及半定量分析免疫组织化学染色(Immunohistochemical,IHC)方法检测110例ESCC病变前各阶段活检组织和162例五年随访ESCC患者组织及癌旁组织中TAGLN2的差异表达。IHC染色评分首先根据细胞染色强度进行评分。再根据免疫染色阳性细胞数占组织总细胞数的百分比评分。最终两次统计分值相乘,即为IHC分值。1.2.4稳定细胞株构建应用慢病毒稳转技术对NE6细胞过表达TAGLN2,对ESCC细胞系9706沉默TAGLN2,构建亚细胞系NE6-T2及对照细胞、9706-sh-T2及对照细胞。1.2.5细胞核质分离蛋白检测参照NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents试剂盒说明书进行细胞核质分离,采用Western blot检测细胞核、细胞质蛋白。1.3统计学分析方法统计学分析均采用SPSS17.0软件分析。T-test统计检验两组间差异,RT-PCR、Western blot检测条带及IHC检测结果存在有序变量时采用Mann-whitney或Wilcoxon检验;卡方检验的Gamma test检验参数间的相关性;卡方检验或Fisher精确检验分析ESCC患者临床病理指标与TAGLN2表达的相关性;Kaplan-Meier法绘制生存曲线,各组间的比较采用Logrank检验,Cox回归模型分析ESCC预后影响因素。检验水准为P<0.05。2结果2.1 TAGLN2 mRNA在ESCC组织中高于相应癌旁组织(P<0.05),且TAGLN2 mRNA表达水平升高与ESCC发展存在正相关(P<0.05),TAGLN2 mRNA表达水平随着ESCC发展而升高。2.2从NEE发展至LGIN,再至HGIN病变,TAGLN2表达逐渐升高;随ESCC临床TNM分期进展,TAGLN2的表达也逐渐升高;TAGLN2蛋白在食管上皮永生化细胞NEC、NE6中的表达均低于ESCC细胞系。2.3 IHC染色结果显示TAGLN2在ESCC组织细胞中高表达,主要定位于细胞膜及细胞质中,在癌旁组织中呈低表达;从NEE到LGIN,再从LGIN到HGIN组织中TAGLN2的表达逐渐升高(P<0.05),TAGLN2从HGIN到ESCC中表达差异不明显;TAGLN2表达水平与ESCC癌前病变进展及ESCC各期进展呈正相关;TAGLN2蛋白表达与淋巴转移及TNM分期呈正相关(P<0.05);而与性别、年龄、T-stage、分化程度无显著相关性(P>0.05)。2.4 TAGLN2及各临床病理资料与根治性手术后生存期的相关性TAGLN2表达升高与ESCC患者术后五年总体生存率呈负相关(P<0.05);在TNMⅠ-Ⅱ期ESCC中TAGLN2表达升高与患者术后五年生存率呈正相关(P<0.05),而在TNMⅢ-Ⅳ期TAGLN2的表达与ESCC患者术后五年总体生存率无显著相关性(P>0.05)。2.5影响ESCC预后的单因素、多因素分析单因素Cox回归分析结果显示:患者性别、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期、TAGLN2表达水平是影响ESCC患者术后总体生存期的重要因素(P<0.05),还不能认为年龄、病理分期能影响ESCC术后总体生存期(P>0.05);Cox多因素回归分析显示:TAGLN2是ESCC术后独立危险因素(P<0.05),性别、浸润深度分级、淋巴结转移与否、临床TNM分期尚不能认为是ESCC预后的独立危险因素(P>0.05)。2.6 TAGLN2与YAP/TAZ相关性YAP、TAZ蛋白在ESCC组织中表达高于癌旁组织,T检验蛋白条带的半定量分析显示差异显著(P<0.05)。TAZ与TAGLN2同时在癌中升高比例达75%,YAP与TAGLN2同时升高比例达到62.5%,表明TAGLN2与YAP、TAGLN2与TAZ存在正相关性。NE6-T2及9706-sh-T2亚细胞系与其对应对照细胞的细胞核内YAP/TAZ蛋白相比显著降低。3结论3.1 TAGLN2表达变异发生于ESCC癌前病变,并随ESCC发展逐渐升高,TAGLN2可能是ESCC分子诊断、预防和治疗分子靶点之一;3.2 TAGLN2表达水平与ESCC的临床分期呈正相关,与ESCC术后五年总体生存率存在负相关,且是ESCC术后生存期的独立危险因素之一。TAGLN2可能是ESCC术后生存期预警评估分子之一。3.3 TAGLN2与Hippo信号通路中的靶分子YAP和TAZ表达呈正相关性,且TAGLN2促进YAP/TAZ入核。TAGLN2可能通过影响YAP和TAZ的入核增多促进了ESCC演进。