2021年全球癌症统计报告显示结肠癌已成为全球第三大常见癌症,并在肿瘤相关性死亡原因中位居第二。在中国,结肠癌的发病率和死亡率近几十年来持续增长。尽管结肠癌的筛查方案和治疗模式不断改进,但远处转移的结肠癌患者的5年生存率仅为14%。因此,急需寻找新的治疗方案用于治疗结肠癌。肿瘤免疫治疗,包括主动免疫治疗、被动免疫治疗和免疫检查点阻断,已经成为一个新的肿瘤治疗研究方法并受到了极大的关注。γδTT细胞约占所有循环T细胞总数的5%,在先天性和适应性免疫监视中起着关键作用。Vγ9Vδ2T细胞是人类外周血yδT细胞的主要亚群（50-90%）,具有较高的抗肿瘤能力,在体外环境中可杀死多种肿瘤细胞,但在实体瘤的临床试验中疗效有限,因此如何提高γδT细胞对实体瘤的杀伤效应成为了急需研究的问题。B7-H3作为负性共刺激分子B7超家族的重要成员,已被证明可调节多种免疫细胞的生物功能,如巨噬细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞,在调节先天性和适应性免疫应答中发挥双重作用。但尚未有文献报道B7-H3对结肠癌中γδT细胞生物学功能及潜在机制的影响。因此,我们以结肠癌为研究对象,从中探索B7-H3是否以及如何调节γδT细胞的特性和对结肠癌的抗肿瘤作用,以期为未来的结肠癌免疫治疗提供一个新的治疗思路及方案。第一部分B7-H3与γδT细胞影响结肠癌的发生发展目的:初步分析结肠癌微环境中γδT细胞的表达情况,并从中筛选最适宜的免疫检查点分子,进而研究二者对结肠癌发生发展的影响。方法:以结肠癌患者为研究对象,分别在外周血及肿瘤组织中检测γδT细胞所占的细胞比例;流式细胞术检测结肠癌患者循环γδT细胞中各种免疫检查点分子亚型（B7-H3+γδT 细胞、PD-1+γδT 细胞、PD-L1+γδT 细胞、Trem-1+γδT 细胞、Tim-3+γδT细胞）的细胞比例,从中筛选出细胞比例最高的分子亚型;再次检测该分子亚型在结肠癌患者外周血及肿瘤组织γδT细胞中的细胞比例;收集临床资料,分析γδT细胞与所筛选出的分子亚型在结肠癌中的临床意义。结果:（1）与健康志愿者相比,结肠癌患者外周血中γδT细胞的细胞比例明显降低;与癌旁组织相比,患者肿瘤组织中γδT细胞的浸润比例也显著降低;（2）结肠癌患者循环γδT细胞中B7-H3+ γδT细胞的细胞比例最高;（3）与健康志愿者或癌旁组织相比,结肠癌患者循环γδT细胞和肿瘤浸润型γδT细胞中B7-H3+γδT细胞的细胞比例均显著上升;（4）γδT细胞、B7-H3+γδT细胞与结肠癌的远处转移、TNM分期密切相关。结论:本部分研究发现结肠癌中γδT细胞的细胞比例显著下降,但B7-H3+γδT亚型细胞的细胞比例显著上升,表明B7-H3可能参与调控结肠癌中γδT细胞的生物学功能。第二部分结肠癌中B7-H3对γδT细胞生物学功能的影响目的:初步探讨B7-H3对结肠癌中γδT细胞生物学功能的影响。方法:采用B7-H3抗体MIH35阻断Vδ2T细胞胞膜上B7-H3的功能或使用B7-H3小干扰RNA（siRNA）转染Vδ2T细胞阻断B7-H3的表达以及使用B7-H3激活剂4H7刺激Vδ2T细胞后流式细胞术检测并分析B7-H3对Vδ2T细胞增殖、凋亡、活化、分化的影响;以结肠癌外周血及肿瘤组织为研究对象,检测γδT细胞功能亚型的表达情况,并分析与B7-H3+γδT细胞的相关性;使用CCK-8法和细胞成簇功能检测B7-H3对Vδ2T结肠癌细胞（HCT116、RKO及SW480细胞）的杀伤能力。结果:（1）降低B7-H3的表达或阻断B7-H3功能后显著促进Vδ2T细胞的增殖、活化标志物（CD25和CD69）的表达以及IFN-γ+yδT细胞的分化,抑制Vδ2T细胞的凋亡;而在刺激B7-H3表达后可观察到相反的结果;（2）与健康志愿者外周血或结肠癌患者自身癌旁组织相比,结肠癌患者循环γδT细胞和肿瘤浸润性γδT细胞中IFN-γ+γδT细胞的细胞比例均显著降低,并与B7-H3+γδT细胞呈负相关性;（3）B7-H3可抑制γδT细胞对结肠癌细胞系HCT116、RKO或SW480细胞的杀伤功能。结论:B7-H3主要抑制结肠癌中γδT细胞的增殖、活化、IFN-γ+γδT细胞亚型的分化和抗肿瘤功能,促进γδT细胞的凋亡。第三部分结肠癌中B7-H3调控γδT细胞抗肿瘤功能的机制研究目的:探寻并验证B7-H3调控γδT细胞抗肿瘤功能所涉及的相关机制,初步分析γδT细胞在体内的治疗效果。方法:以肿瘤细胞HCT116、RKO为研究对象,在经B7-H3 siRNA转染后的Vδ2T细胞中加入IFN-γ抗体,通过CCK-8法及细胞成簇能力观察Vδ2T细胞的细胞毒性;在4H7刺激后的Vδ2T细胞中加入人重组化IFN-γ因子,再次通过CCK-8法及细胞成簇能力观察Vδ2T细胞的细胞毒性;RT-qPCR法筛选Vδ2T细胞中可调控IFN-γ生成的关键基因;将该基因的小干扰RNA与B7-H3 siRNA共转染至Vδ2T细胞中,流式细胞术及Western blot检测蛋白层面上B7-H3、IFN-γ及该基因的表达情况;ELISA评估B7-H3对Vδ2T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B的影响;在经B7-H3 siRNA转染后的Vδ2T细胞中分别加入穿孔素抑制剂CMA和颗粒酶B抑制剂BCL-2或在4H7刺激后的Vδ2T细胞中加入人重组化颗粒酶B因子,观察Vδ2T细胞的抗肿瘤功能;以SCID小鼠构建人源化结肠癌荷瘤模型,并序贯注射B7-H3阻断抗体MIH35及Vδ2T细胞进行治疗,记录肿瘤生长曲线及重量,流式细胞术分析外周血及肿瘤组织中Vδ2T细胞内IFN-γ、颗粒酶B的表达情况。结果:（1）IFN-γ抗体逆转了 B7-H3干扰造成的Vδ2T细胞对结肠癌细胞的细胞毒性的促进作用,而重组人IFN-γ因子抵消了 4H7刺激对Vδ2T细胞对结肠癌细胞的细胞毒性的抑制作用;（2）B7-H3通过调控转录因子T-bet的表达抑制Vδ2T细胞中IFN-γ的生成;（3）B7-H3抑制Vδ2T细胞中穿孔素和颗粒酶B的分泌;（4）CMA或BCL-2的添加显著降低了 B7-H3干扰后Vδ2T细胞增强的抗肿瘤能力,而重组人颗粒酶B的添加抵消了 4H7刺激对Vδ2T细胞抗肿瘤能力的抑制作用;（5）动物实验表明MIH35与γδT细胞联合使用的治疗效果最佳,并在小鼠体内发现B7-H3可抑制γδT细胞分泌IFN-γ及颗粒酶B。结论:B7-H3通过下调T-bet的表达抑制Vδ2T细胞分泌IFN-γ,从而抑制Vδ2T细胞的细胞毒性,也可通过抑制穿孔素和颗粒酶B的表达来抑制Vδ2T细胞的抗肿瘤功能。综上所述,我们发现结肠癌外周血及组织中γδT细胞的细胞比例明显下降,而的T细胞中B7-H3+γδT细胞的细胞比例显著增加,并且这两者均与结肠癌的远处转移密切相关。B7-H3抑制γδT细胞的增殖、活化、IFN-γ+ γδT亚型的分化及细胞毒性,促进γδT细胞的凋亡。B7-H3阻断性抗体MIH35与γδT细胞的联合使用显著减缓SCID小鼠中结肠癌的生长。B7-H3通过控制IFN-γ和穿孔素/颗粒酶B的分泌抑制yδT细胞对结肠癌的杀伤功能。以上结果表明,B7-H3+ γδT细胞可作为结肠癌预后及免疫疗效的潜在标志物,抑制或阻断B7-H3结合Vδ2T细胞可成为结肠癌的一种潜在的免疫治疗方法。