论文部分内容阅读
目的：探讨紫外线B(Ultraviolet B, UVB)引起人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells, HLECs )凋亡的机制和绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)的保护作用，阐释p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases, p38MAPK)信号通路、氧化损伤、内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)在UVB诱发HLECs细胞凋亡的作用机制以及EGCG的保护作用。
方法：本实验分为三部分。第一部分：HLECs细胞培养并筛选半数致死量的UVB照射剂量和EGCG的安全有效浓度，验证10μM的p38抑制剂SB203580对HLECS细胞的毒性。采用人晶状体上皮细胞系HLEB-3为研究模型，采用中心照射强度为0.2mW／cm2的UVB光源，照射剂量分别为10、20、40和60mJ／cm2对HLEB-3进行照射，照射完毕后继续培养。用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG浓度(浓度分别为0、10、20、40、60、80、90、100、120和150μg/ml)分别培养细胞24h、48h；同时，用含10%胎牛血清1640培养基的SB203580(10μM)培养细胞24h、48h。倒置相差荧光显微镜下观察UVB照射后细胞形态学变化；cck-8检测UVB照射后细胞活性、不同浓度EGCG溶液的细胞毒性、10μM的SB203580溶液的细胞毒性。第二部分：基于p38MAPK信号通路探讨紫外线诱导人晶状体上皮细胞凋亡的作用机制。实验分为正常对照组、SB203580组、UVB组和UVB+SB203580组。其中正常对照组、SB203580组无UVB照射，SB203580组和UVB+SB203580用含10%胎牛血清1640培养基的SB203580(10μM)预处理2h。UVB组、UVB+SB203580组UVB照射剂量为40mJ／cm2，照射后分别继续培养6h、24h，然后收集细胞进行相关检测分析。cck-8检测UVB照射后6h、24h各实验组细胞活性；流式细胞仪检测分析UVB照射后细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平、线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,ΔΨm)变化和细胞凋亡情况；采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测UVB照射后HLEB-3细胞内p38MAPK、磷酸化p38(phospho-p38, p-p38)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、C／EBP同源蛋白(C/EBP homologus protein, CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78kD, GRP78)、钙网蛋白(calreticulin, CRT)分子的mRNA和蛋白表达的变化。第三部分：EGCG通过阻断p38MAPK信号通路抑制UVB诱导的HLECs细胞凋亡的作用机制的研究。实验分正常对照组、EGCG低浓度组、EGCG高浓度组、UVB组、UVB+EGCG低浓度组和UVB+EGCG高浓度组。其中EGCG低浓度组和UVB+EGCG低浓度组用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG(浓度为20μg/ml)预处理2h；EGCG高浓度组和UVB+EGCG高浓度组在UVB照射处理前用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG(浓度为80μg/ml)预处理2h；正常对照组、EGCG低浓度组、EGCG高浓度组无UVB照射；UVB组、UVB+EGCG低浓度组、UVB+EGCG高浓度组用UVB照射剂量40mJ/cm2进行照射处理，照射后继续培养，在指定的时间点采集细胞进行不同的分析。倒置相差荧光显微镜下，观察记录细胞形态学变化；cck-8检测UVB照射后各实验组细胞活性；应用流式细胞仪检测分析UVB照射后细胞内ROS水平、ΔΨm变化和细胞凋亡情况；采用Q-PCR和WesternBlot方法分析检测HLEB-3细胞内p38、p-p38、Caspase-3、CHOP、GRP78、CRT分子在UVB照射后mRNA和蛋白表达量的变化。
结果：
第一部分
1.UVB照射后HLEB-3细胞形态和数量发生显著改变，细胞数量减少、细胞呈长梭形，并且随着照射剂量的增加该改变愈加明显。
2.正常HLEB-3细胞经UVB照射后，细胞生存率下降，并存在剂量与时间依赖关系(P＜0.01)。照射剂量为40mJ/cm2培养6h细胞生存率大约为55%，我们实验中选用40mJ/cm2作为实验照射剂量。
3.EGCG浓度为0-80μg/ml时对HLEB-3细胞无明显毒性作用，即在该浓度范围内细胞增殖能力无明显改变。
4.SB203580浓度为10μM时对HLEB-3细胞无明显毒性作用。
第二部分
1.细胞生存率和细胞凋亡的变化：UVB照射可以明显降低HLEB-3细胞的生存率(P＜0.01)。UVB照射的HLEB-3细胞早期凋亡细胞比例和晚期凋亡和/或坏死细胞比例增加(P＜0.01)。p38阻滞剂SB203580干预后可以提高细胞的生存率并减少凋亡细胞比例(P＜0.01)。
2.细胞内ROS产生情况：与正常对照组相比，UVB照射后HLEB-3细胞内ROS水平显著提高(P＜0.01)，SB203580干预后可以减少UVB照射后HLEB-3细胞内ROS产生(P＜0.01)。
3.线粒体膜电位(ΔΨm)水平的变化：UVB照射后导致HLEB-3细胞线粒体功能损伤，ΔΨm显著下降(P＜0.01)；p38阻滞剂SB203580干预后可以明显降低线粒体功能损伤，减少ΔΨm的下降水平(P＜0.01)。
4.细胞凋亡执行者Caspase-3的表达情况：UVB照射后Caspase-3表达显著升高，SB203580干预可显著降低Caspase-3表达水平(P＜0.01)。
以上结果表明，UVB照射后HLEB-3细胞内ROS增加诱导细胞发生凋亡，这是UVB导致白内障的发生的主要机制之一。抑制p38MAPK可显著减少UVB诱导产生的ROS和HLECS细胞凋亡，从而保护HLEB-3细胞免受UVB照射引发的细胞损伤。
5.p38信号通路上相关分子的mRNA和蛋白表达情况：UVB照射后可以引起HLEB-3细胞内p38信号通路活化，p38表达量增加，同时磷酸化的p38蛋白表达量也增加(P＜0.01)。SB203580干预后可以抑制p38磷酸化。该结果表明UVB照射可以激活HLEB-3细胞中p38信号通路，引起细胞凋亡,证实了p38活化在UVB诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。
6.内质网应激标志性分子的表达情况：UVB照射后激活HLEB-3细胞内质网应激反应，引起细胞凋亡。细胞内内质网应激主要标志分子GRP78、CHOP、CRT高水平表达，(P＜0.01)。SB203580干预可以降低GRP78、CHOP、CRT表达量(P＜0.01)，抑制UVB诱导的内质网应激，抑制细胞凋亡。实验结果还表明P38信号通路活化发生在内质网应激的上游。
第三部分：
1.细胞形态学改变：UVB照射后HLEB-3细胞出现形态和数量的异常改变，EGCG干预可有效改善HLEB-3细胞形态和数量的异常改变，保持人晶状体上皮细胞的原有特征，且呈浓度依赖性，表明EGCG对UVB照射的HLECS细胞具有保护作用。
2.细胞生存率变化情况：EGCG提高了UVB照射后HLEB-3细胞的生存率，呈剂量依赖性(P＜0.05)，提示EGCG干预可以恢复UVB照射后HLEB-3细胞的活力。
3.细胞凋亡情况：正常对照组相比，UVB照射的HLEB-3细胞早期凋亡细胞比例和晚期凋亡和/或坏死细胞比例增加(P=0.001，0.000)，EGCG干预可显著降低UVB照射诱导的HLEB-3细胞凋亡(P＜0.01)。高浓度EGCG和低浓度EGCG干预均可降低早期凋亡细胞比例，但两者之间无明显差异(P=0.094)。
4.细胞内ROS的产生情况：与正常对照组相比，UVB照射后，细胞内ROS水平显著提高(P＜0.01)，EGCG干预后可以显著缓解UVB照射后HLEB-3细胞内ROS升高(P＜0.01)，且存在浓度依赖性。
5.线粒体膜电位(ΔΨm)水平的变化：与正常对照组相比，UVB照射后，HLEB-3细胞ΔΨm水平显著降低(P＜0.01)，EGCG干预可有效减少线粒体功能损伤，减轻ΔΨm水平的下降(P＜0.01)，且存在浓度依赖性。
以上结果表明，EGCG具有很强的ROS淬灭能力，阻断了UVB介导的氧化损伤中的初始和直接细胞事件，减轻UVB诱导的氧化损伤引起的细胞凋亡。
6.细胞中Caspase-3表达量的变化：UVB照射后Caspase-3表达急剧升高，EGCG干预可显著降低Caspase-3表达水平(P＜0.01)。
7.p38信号通路上相关分子的表达情况：与正常对照组比较，UVB照射激活了P38通路，增加p38磷酸化水平，细胞中p38和p-p38表达增加(P＜0.01)，EGCG干预后阻断了UVB诱导HLEB-3细胞中p38活化，降低了p38磷酸化水平(P＜0.01)，这些结果表明UVB诱导的p38通路的激活可被EGCG阻断。
8.内质网应激标志性分子的表达情况:UVB照射产生的ROS可导致内质网应激及随后引起的细胞凋亡。与正常对照组比较，UVB照射激活了HLEB-3细胞中内质网应激，GRP78和CHOP表达增加，EGCG干预可减少GRP78和CHOP的表达水平(P＜0.01)。这些结果表明EGCG可以缓解UVB照射引起的HLEB-3细胞中的内质网应激。
以上结果表明，p38通路的激活和内质网应激发生在UVB照射之后，EGCG可以抑制p38通路的激活和内质网应激，从而抑制UVB诱导的细胞凋亡。
结论：
第一部分
1.UVB照射后HLEB-3细胞形态和数量发生异常改变，细胞生存率下降，且与UVB辐照呈剂量依赖性，这是UVB导致白内障发生的主要机制之一。
2.EGCG浓度为0-80μg/ml时对HLEB-3细胞增殖无明显毒性作用。
第二部分
1.过量UVB辐照可导致HLEB-3细胞活力的下降和细胞凋亡的发生。
2.UVB照射产生的ROS介导了p38MAPK信号通路的活化及线粒体损伤和内质网应激，诱导了HLEB-3细胞的凋亡。
3.抑制p38MAPK信号通路可减少UVB诱导产生的ROS、线粒体损伤、HLECS细胞凋亡，保护HLEB-3细胞免受UVB照射引发的细胞损伤和凋亡。
4.UVB照射HLEB-3细胞诱导的p38MAPK信号通路的活化发生在内质网应激的上游，阻断p38MAPK信号通路可以抑制内质网应激。
5.p38MAPK在UVB诱导的HLECs凋亡中可发挥重要作用，可能成为白内障治疗的重要靶点。
第三部分
1.EGCG具有非常显著的ROS猝灭活性，可以阻断UVB照射HLEB-3细胞引起的线粒体损伤、p38MAPK途径活化和内质网应激，从而抑制UVB诱导的细胞凋亡。
2.EGCG在保护HLEB-3细胞抵抗UVB诱导的氧化应激和细胞凋亡中起重要作用。这些发现可以为EGCG将来成为一种有效预防和治疗白内障保护的药物提供理论依据。
方法：本实验分为三部分。第一部分：HLECs细胞培养并筛选半数致死量的UVB照射剂量和EGCG的安全有效浓度，验证10μM的p38抑制剂SB203580对HLECS细胞的毒性。采用人晶状体上皮细胞系HLEB-3为研究模型，采用中心照射强度为0.2mW／cm2的UVB光源，照射剂量分别为10、20、40和60mJ／cm2对HLEB-3进行照射，照射完毕后继续培养。用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG浓度(浓度分别为0、10、20、40、60、80、90、100、120和150μg/ml)分别培养细胞24h、48h；同时，用含10%胎牛血清1640培养基的SB203580(10μM)培养细胞24h、48h。倒置相差荧光显微镜下观察UVB照射后细胞形态学变化；cck-8检测UVB照射后细胞活性、不同浓度EGCG溶液的细胞毒性、10μM的SB203580溶液的细胞毒性。第二部分：基于p38MAPK信号通路探讨紫外线诱导人晶状体上皮细胞凋亡的作用机制。实验分为正常对照组、SB203580组、UVB组和UVB+SB203580组。其中正常对照组、SB203580组无UVB照射，SB203580组和UVB+SB203580用含10%胎牛血清1640培养基的SB203580(10μM)预处理2h。UVB组、UVB+SB203580组UVB照射剂量为40mJ／cm2，照射后分别继续培养6h、24h，然后收集细胞进行相关检测分析。cck-8检测UVB照射后6h、24h各实验组细胞活性；流式细胞仪检测分析UVB照射后细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平、线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,ΔΨm)变化和细胞凋亡情况；采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测UVB照射后HLEB-3细胞内p38MAPK、磷酸化p38(phospho-p38, p-p38)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、C／EBP同源蛋白(C/EBP homologus protein, CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78kD, GRP78)、钙网蛋白(calreticulin, CRT)分子的mRNA和蛋白表达的变化。第三部分：EGCG通过阻断p38MAPK信号通路抑制UVB诱导的HLECs细胞凋亡的作用机制的研究。实验分正常对照组、EGCG低浓度组、EGCG高浓度组、UVB组、UVB+EGCG低浓度组和UVB+EGCG高浓度组。其中EGCG低浓度组和UVB+EGCG低浓度组用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG(浓度为20μg/ml)预处理2h；EGCG高浓度组和UVB+EGCG高浓度组在UVB照射处理前用含10%胎牛血清1640培养基的EGCG(浓度为80μg/ml)预处理2h；正常对照组、EGCG低浓度组、EGCG高浓度组无UVB照射；UVB组、UVB+EGCG低浓度组、UVB+EGCG高浓度组用UVB照射剂量40mJ/cm2进行照射处理，照射后继续培养，在指定的时间点采集细胞进行不同的分析。倒置相差荧光显微镜下，观察记录细胞形态学变化；cck-8检测UVB照射后各实验组细胞活性；应用流式细胞仪检测分析UVB照射后细胞内ROS水平、ΔΨm变化和细胞凋亡情况；采用Q-PCR和WesternBlot方法分析检测HLEB-3细胞内p38、p-p38、Caspase-3、CHOP、GRP78、CRT分子在UVB照射后mRNA和蛋白表达量的变化。
结果：
第一部分
1.UVB照射后HLEB-3细胞形态和数量发生显著改变，细胞数量减少、细胞呈长梭形，并且随着照射剂量的增加该改变愈加明显。
2.正常HLEB-3细胞经UVB照射后，细胞生存率下降，并存在剂量与时间依赖关系(P＜0.01)。照射剂量为40mJ/cm2培养6h细胞生存率大约为55%，我们实验中选用40mJ/cm2作为实验照射剂量。
3.EGCG浓度为0-80μg/ml时对HLEB-3细胞无明显毒性作用，即在该浓度范围内细胞增殖能力无明显改变。
4.SB203580浓度为10μM时对HLEB-3细胞无明显毒性作用。
第二部分
1.细胞生存率和细胞凋亡的变化：UVB照射可以明显降低HLEB-3细胞的生存率(P＜0.01)。UVB照射的HLEB-3细胞早期凋亡细胞比例和晚期凋亡和/或坏死细胞比例增加(P＜0.01)。p38阻滞剂SB203580干预后可以提高细胞的生存率并减少凋亡细胞比例(P＜0.01)。
2.细胞内ROS产生情况：与正常对照组相比，UVB照射后HLEB-3细胞内ROS水平显著提高(P＜0.01)，SB203580干预后可以减少UVB照射后HLEB-3细胞内ROS产生(P＜0.01)。
3.线粒体膜电位(ΔΨm)水平的变化：UVB照射后导致HLEB-3细胞线粒体功能损伤，ΔΨm显著下降(P＜0.01)；p38阻滞剂SB203580干预后可以明显降低线粒体功能损伤，减少ΔΨm的下降水平(P＜0.01)。
4.细胞凋亡执行者Caspase-3的表达情况：UVB照射后Caspase-3表达显著升高，SB203580干预可显著降低Caspase-3表达水平(P＜0.01)。
以上结果表明，UVB照射后HLEB-3细胞内ROS增加诱导细胞发生凋亡，这是UVB导致白内障的发生的主要机制之一。抑制p38MAPK可显著减少UVB诱导产生的ROS和HLECS细胞凋亡，从而保护HLEB-3细胞免受UVB照射引发的细胞损伤。
5.p38信号通路上相关分子的mRNA和蛋白表达情况：UVB照射后可以引起HLEB-3细胞内p38信号通路活化，p38表达量增加，同时磷酸化的p38蛋白表达量也增加(P＜0.01)。SB203580干预后可以抑制p38磷酸化。该结果表明UVB照射可以激活HLEB-3细胞中p38信号通路，引起细胞凋亡,证实了p38活化在UVB诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。
6.内质网应激标志性分子的表达情况：UVB照射后激活HLEB-3细胞内质网应激反应，引起细胞凋亡。细胞内内质网应激主要标志分子GRP78、CHOP、CRT高水平表达，(P＜0.01)。SB203580干预可以降低GRP78、CHOP、CRT表达量(P＜0.01)，抑制UVB诱导的内质网应激，抑制细胞凋亡。实验结果还表明P38信号通路活化发生在内质网应激的上游。
第三部分：
1.细胞形态学改变：UVB照射后HLEB-3细胞出现形态和数量的异常改变，EGCG干预可有效改善HLEB-3细胞形态和数量的异常改变，保持人晶状体上皮细胞的原有特征，且呈浓度依赖性，表明EGCG对UVB照射的HLECS细胞具有保护作用。
2.细胞生存率变化情况：EGCG提高了UVB照射后HLEB-3细胞的生存率，呈剂量依赖性(P＜0.05)，提示EGCG干预可以恢复UVB照射后HLEB-3细胞的活力。
3.细胞凋亡情况：正常对照组相比，UVB照射的HLEB-3细胞早期凋亡细胞比例和晚期凋亡和/或坏死细胞比例增加(P=0.001，0.000)，EGCG干预可显著降低UVB照射诱导的HLEB-3细胞凋亡(P＜0.01)。高浓度EGCG和低浓度EGCG干预均可降低早期凋亡细胞比例，但两者之间无明显差异(P=0.094)。
4.细胞内ROS的产生情况：与正常对照组相比，UVB照射后，细胞内ROS水平显著提高(P＜0.01)，EGCG干预后可以显著缓解UVB照射后HLEB-3细胞内ROS升高(P＜0.01)，且存在浓度依赖性。
5.线粒体膜电位(ΔΨm)水平的变化：与正常对照组相比，UVB照射后，HLEB-3细胞ΔΨm水平显著降低(P＜0.01)，EGCG干预可有效减少线粒体功能损伤，减轻ΔΨm水平的下降(P＜0.01)，且存在浓度依赖性。
以上结果表明，EGCG具有很强的ROS淬灭能力，阻断了UVB介导的氧化损伤中的初始和直接细胞事件，减轻UVB诱导的氧化损伤引起的细胞凋亡。
6.细胞中Caspase-3表达量的变化：UVB照射后Caspase-3表达急剧升高，EGCG干预可显著降低Caspase-3表达水平(P＜0.01)。
7.p38信号通路上相关分子的表达情况：与正常对照组比较，UVB照射激活了P38通路，增加p38磷酸化水平，细胞中p38和p-p38表达增加(P＜0.01)，EGCG干预后阻断了UVB诱导HLEB-3细胞中p38活化，降低了p38磷酸化水平(P＜0.01)，这些结果表明UVB诱导的p38通路的激活可被EGCG阻断。
8.内质网应激标志性分子的表达情况:UVB照射产生的ROS可导致内质网应激及随后引起的细胞凋亡。与正常对照组比较，UVB照射激活了HLEB-3细胞中内质网应激，GRP78和CHOP表达增加，EGCG干预可减少GRP78和CHOP的表达水平(P＜0.01)。这些结果表明EGCG可以缓解UVB照射引起的HLEB-3细胞中的内质网应激。
以上结果表明，p38通路的激活和内质网应激发生在UVB照射之后，EGCG可以抑制p38通路的激活和内质网应激，从而抑制UVB诱导的细胞凋亡。
结论：
第一部分
1.UVB照射后HLEB-3细胞形态和数量发生异常改变，细胞生存率下降，且与UVB辐照呈剂量依赖性，这是UVB导致白内障发生的主要机制之一。
2.EGCG浓度为0-80μg/ml时对HLEB-3细胞增殖无明显毒性作用。
第二部分
1.过量UVB辐照可导致HLEB-3细胞活力的下降和细胞凋亡的发生。
2.UVB照射产生的ROS介导了p38MAPK信号通路的活化及线粒体损伤和内质网应激，诱导了HLEB-3细胞的凋亡。
3.抑制p38MAPK信号通路可减少UVB诱导产生的ROS、线粒体损伤、HLECS细胞凋亡，保护HLEB-3细胞免受UVB照射引发的细胞损伤和凋亡。
4.UVB照射HLEB-3细胞诱导的p38MAPK信号通路的活化发生在内质网应激的上游，阻断p38MAPK信号通路可以抑制内质网应激。
5.p38MAPK在UVB诱导的HLECs凋亡中可发挥重要作用，可能成为白内障治疗的重要靶点。
第三部分
1.EGCG具有非常显著的ROS猝灭活性，可以阻断UVB照射HLEB-3细胞引起的线粒体损伤、p38MAPK途径活化和内质网应激，从而抑制UVB诱导的细胞凋亡。
2.EGCG在保护HLEB-3细胞抵抗UVB诱导的氧化应激和细胞凋亡中起重要作用。这些发现可以为EGCG将来成为一种有效预防和治疗白内障保护的药物提供理论依据。