研究背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是婴幼儿最常见的恶性实性肿瘤,其发病率约占儿童肿瘤的7%-10%。神经母细胞瘤一般起源于交感神经节或肾上腺髓质的原始神经嵴细胞,男性发病率略高。与其它肿瘤相比,神经母细胞瘤恶性程度高,常在短期内突破包膜而浸润周围组织及器官而发生转移。原则上有交感神经节的部位均可发生肿瘤,颈部、胸部、腹部及腹膜后均是神经母细胞瘤的好发部位。多种分子生物学的异常被认为与神经母细胞瘤有着密切的关系,如MYCN异常表达、抑癌基因序列1p36.1及1p36.2缺失等分子生物学的异常均已逐步成为儿童神经母细胞瘤分级的重要指标。尽管神经母细胞瘤的分子生物学研究已取得重大进展,然而儿童神经母细胞瘤的预后并未有明显的改善,探索新的分子靶向治疗途径是我们研究的重要方向。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类广泛存在真核生物体内的长度为21～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA。miRNA通过与RNA诱导沉默复合物(RNA induced silence complex, RISC)结合形成非对称性的RISC,而结合RISC后可与靶基因结合而达到降解mRNA或抑制mRNA转录后的翻译,最终通过调节蛋白表达而在体内多个重要环节中发挥作用。大量研究表明miRNA在肿瘤中存在明显异常表达,而niRNA的异常表达对肿瘤的增殖、侵袭及转移均发挥着重要的作用。前期Guo等通过miRNA基因芯片检测高危组神经母细胞瘤与低危组神经母细胞瘤的miRNA表达谱发现,高危组与低危组神经母细胞瘤的miRNA表达谱存在差异,如在高危组中,miR-17-92, miR-181, miR-21, miR-380-5p, miR-483-3p等明显上调,而miR-34a, miR-542-5p, let-7, miR-204等明显下调。功能实验中亦证实多种miRNA在神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、分化、侵袭及转移中发挥着重要的作用。miR-483最早于人体新生儿的肝脏组织中发现,其定位于染色体11p15的IGF-2基因内含子内。其主要包括miR-483-3p及miR-483-5p两种,两者均在肿瘤中发挥着重要的作用。如miR-483-3p在肝癌中发挥着癌基因的作用,通过抑制其表达后可以明显的促进肿瘤细胞的凋亡,而miR-483-5p亦被证明在肾上腺皮质肿瘤中发挥着癌基因的作用。过往研究采用miRNA基因芯片检测发现高危组的神经母细胞瘤的miR-483-3p表达量明显高于低危组,然而其对神经母细胞瘤的作用及机制目前尚未见报道。本研究首先通过qRT-PCR验证miR-483-3p在神经母细胞瘤组织标本及细胞中的表达情况,并进一步在细胞及动物实验中验证miR-483-3p对神经母细胞瘤的增殖、凋亡、侵袭及转移的影响,并通过计算机软件预测及分子生物学实验探索了miR-483-3p对神经母细胞瘤发挥作用的可能机制。研究内容与结果第一部分：miR-483-3p在人神经母细胞瘤组织标本及细胞中的表达及意义1.1目的通过qRT-PCR技术验证高危组神经母细胞瘤(转移瘤)及中低危组神经母细胞瘤(原发瘤)组织标本及细胞株中的miR-483-3p的表达差异。1.2方法①收集组织标本,并详细记录组织标本对应的肿瘤病理类型、分级、分期、年龄、NMYC基因扩增倍数等相关资料,标本于液氮速冻后于-70℃冰箱内保存。购买神经母细胞瘤细胞株,快速复苏细胞后采用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞培养；②取等量组织标本在冰上研磨(等量细胞),利用RNA提取试剂盒(操作严格按说明书进行)提取总RNA；③使用一步法配置RNA反转录液后,将RNA反转录合成cDNA;④按说明书配置RT-PCR反应液,利用PCR仪对miR-483-3p进行扩增；⑤采用Quantitation-Comparative Ct软件对结果进行分析。1.3结果高危组神经母细胞瘤组织标本中的miR-483-3p的表达量明显高于低危组神经母细胞瘤组织标本(t=6.171, P=0.000), miR-483-3p的表达量随着肿瘤的分期升高而升高(F=12.267,P=0.000)。神经母细胞瘤细胞的miR-483-3p表达量明显高于正常细胞(F=30.998,P=0.000),恶性度高的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y、SK-N-BE)的miR-483-3p表达量亦明显高于恶性度较低的细胞株(IMR-32)(均P<0.05)。1.4结论无论是组织标本还是细胞水平,恶性程度高的神经母细胞瘤的miR-483-3p表达水平明显高于恶性程度低的神经母细胞瘤,miR-483-3p可能是神经母细胞瘤诊断分期及预后判断的重要指标。第二部分：miR-483-3p对人神经母细胞瘤细胞体外增殖、凋亡、侵袭及转移的影响2.1目的明确miR-483-3p对人神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等功能的影响。2.2方法①人工合成miR-483-3p mimicss miR-483-3p inhibitors及阴性对照的siRNA,并采用绿色荧光蛋白进行标记；②使用LipolifectmainTM2000将miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及阴性对照转染至神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞株内,并使用荧光显微镜确认其的转染效率；③采用CCK-8法检测miR-483-3p对人神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞株增殖活性的影响；④采用细胞克隆形成实验观察miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞克隆形成能力的影响；⑤流式细胞术检测miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞周期的影响；⑥Transwell法检测miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞迁移及侵袭(加基质胶)的影响。2.3结果LipolifectmainTM2000可以成功的将miR-483-3p mimics及miR-483-3p inhibitors转入神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞株中,荧光显微镜均可见绿色荧光蛋白表达。qRT-PCR结果进一步证实转染miR-483-3p mimics后神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞株中的miR-483-3p表达量上调10-13倍(P均<0.01),而转染miR-483-3p inhibitors后神经母细胞瘤细胞株的miR-483-3p表达量下调2-3倍(P均<0.05)。采用CCK-8法绘制的生长曲线表明上调miR-483-3p的表达可以明显的增强神经母细胞瘤细胞的增殖能力,在miR-483-3p mimics转染48h、72h及96h后神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞的OD值明显升高(P均<0.05),而下调miR-483-3p可明显抑制神经母细胞瘤细胞的增殖能力,其作用48h、72h及96h后OD值明显下降(P均<0.05)。细胞克隆形成实验证明miR-483-3p mimics作用后神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞株的克隆形成数多于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而下调miR-483-3p的表达后神经母细胞瘤细胞的克隆形成数减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测结果表明上调miR-483-3p的表达可以使得神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞处于S期及G2期的细胞明显增加,而处于G0/G1期的细胞明显减少,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),这也提示miR-483-3p mimics可以促进神经母细胞瘤细胞的增殖,使更多细胞进行有丝分裂；而下调miR-483-3p的表达后,处于G0/G1期的细胞增多,而S期及G2期细胞减少(P<0.05),细胞增殖能力下降,凋亡细胞增加。Transwell法实验结果表明niR-483-3p可以影响神经母细胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE细胞的迁移及侵袭能力,上调miR-483-3p表达后神经母细胞瘤的细胞迁徙及侵袭能力增强,迁移至下孔的细胞数多于阴性对照组(P均<0.05)。而转染miR-483-3p inhibitor后下孔的细胞数较阴性对照组减少(P均<0.05),即细胞的迁移及侵袭能力下降。2.4结论上调miR-483-3p可以促进神经母细胞瘤细胞的增殖及克隆形成能力,使得神经母细胞瘤细胞的侵袭及迁移能力明显提高,而抑制miR-483-3p的表达则可以抑制神经母细胞瘤的增殖、侵袭及迁移能力,并促进神经母细胞瘤细胞的凋亡。miR-483-3p在神经母细胞瘤中发挥‘癌基因’的作用。第三部分：miR-483-3p靶基因的鉴定及其调控人神经细胞瘤细胞的机制3.1目的探索miR-483-3p对人神经母细胞瘤细胞作用的可能机制,并通过调节靶基因的表达验证niR-483-3p与靶基因之间的关系。3.2方法①通过miRNA靶标预测软件(miRbase, miRwalk, Targetscan等)结合现有数据库资料,筛选miR-483-3p发挥作用的靶基因；②采用Western blot检测miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞相应靶基因蛋白表达的影响。(主要步骤：a利用细胞裂解液裂解miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及阴性对照siRNA作用后神经母细胞瘤细胞,提抽蛋白；b采用BCA法进行蛋白定量；c依据蛋白分子量配置相应浓度积层胶及分离胶,加入电泳缓冲液,待其凝固后取等量蛋白加入泳道中进行电泳分离蛋白；d利用电转仪进行转膜,将蛋白转移至PVDF膜上；e封闭液封闭后依次加入一抗、二抗进行免疫反应；f加入ECL显影液,进行化学发光反应；g凝胶图像分析);③构建荧光素酶报告基因载体,将其与miR-483-3p mimics及阴性对照siRNA共转染神经母细胞瘤细胞,进行荧光素酶报告检测,验证miR-483-3p与靶基因的3’-UTR之间的关系；④合成针对靶基因的siRNA,观察其对靶基因蛋白表达的影响,使用脂质体转染后观察其对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。⑤合成上调靶基因表达的质粒,观察其对miR-483-3p作用后的神经母细胞瘤细胞功能的影响。3.3结果我们通过靶基因预测软件筛选出了IGF-1及PUMA基因作为miR-483-3p的潜在靶标。Western blot结果表明高表达miR-483-3p后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的PUMA蛋白含量降低(P<0.05),而下调miR-483-3p的表达后神经母细胞瘤的PUMA蛋白表达量较阴性对照组升高(P<0.05)。然而无论是上调还是下调miR-483-3p的表达,神经母细胞瘤细胞中的IGF-1的蛋白表达变化并不明显,与阴性对照组比较差异并不具有统计学意义(P均>0.05)。双荧光素酶实验证实miR-483-3p可以与PUMA的3’-UTR结合,与miR-483-3p共同转染细胞后,PUMA3’-UTR表达量下调,而其不能与突变型PUMA3’-UTR结合,其作用后突变型PUMA 3’-UTR并无明显下降,两者比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。为了进一步验证miR-483-3p发挥作用与PUMA基因有关,我们通过人工合成了针对PUMA基因的siRNA及高表达PUMA基因(不含3’-UTR)的质粒。通过功能实验发现,下调PUMA蛋白表达后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、细胞克隆形成能力明显增强(P均<0.05),发挥着与miR-483-3p类似的作用,而下调PUMA基因后神经母细胞瘤的侵袭及迁移的能力并无明显改变(P均>0.05)。而转染高表达PUMA质粒后可使miR-483-3p作用后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的PUMA蛋白表达量升高,而进一步的功能实验也证实上调PUMA基因的表达可部分逆转miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞的增殖及克隆形成的影响。3.4结论①miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞发挥作用可能与抑制细胞的PUMA基因表达密切相关；②PUMA基因是一种重要的促凋亡因子,下调其表达可以明显促进神经母细胞瘤细胞的增殖及克隆形成能力,而上调其表达可部分逆转miR-483-3p对神经母细胞瘤细胞增殖及克隆形成能力；③miR-483-3p对神经母细胞瘤的作用不仅与PUMA基因有关,还可能通过调节其它基因的表达而发挥作用,具体机制仍有待进一步实验证实。第四部分：miR-483-3p过表达对人神经母细胞瘤细胞裸鼠体内成瘤的影响4.1目的通过体内实验进一步验证niR-483-3p对裸鼠神经母细胞瘤移植瘤生长的影响。4.2方法①合成miR-483-3p高表达质粒(经过靶基因合成、PCR扩增、酶切、连接、转化及质粒提抽等步骤,合成的质粒采用PCR及基因测序进行验证),合成的质粒使用脂质体将其转染至神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内。②转染后使用qRT-PCR验证转染后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中niR-483-3p的表达。③将转染miR-483-3p的SH-SY5Y细胞及转染阴性对照的SH-SY5Y细胞同时种植4-6周龄BALB/C裸鼠臀区皮下,建立裸鼠神经母细胞瘤模型,观察肿瘤体积及变化和各组肿瘤重量,计算抑瘤率,绘制肿瘤生长曲线。④取液氮中保存的动物肿瘤组织标本,封闭后依次加入一抗、二抗、DAB显色,使用显微镜计数两组肿瘤血管密度。⑤采用western blot检测两组移植瘤组织标本中PUMA蛋白的表达。4.3结果转染]miR-483-3p后神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株中的miR-483-3p表达量明显升高,与阴性对照组相比,差异有显著性统计学差异(P<0.01)。4周后稳定转染miR-483-3p的神经母细胞瘤细胞形成的肿瘤体积明显大于阴性对照组(P<0.01),而肿瘤的重量也明显重于阴性对照组(P<0.01)。miR-483-3p转染组的肿瘤微血管密度明显高于阴性对照组,两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测发现转染miR-483-3p组的动物移植瘤标本中PUMA蛋白较阴性对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而这与体外实验结果是一致的。4.4结论通过皮下注射的方法可以成功构建裸鼠神经母细胞瘤的移植瘤模型。上调miR-483-3p的表达可以明显的促进体内神经母细胞瘤肿瘤的生长及血管形成。本实验通过体内实验进一步的证实miR-483-3p发挥作用与调节PUMA蛋白表达有关。