近年来,随着化石燃料的日渐枯竭及环境污染的日益严重,生物质原料的资源化、能源化利用受到人们广泛关注。木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质,其通过生物转化可获得多种燃料和化学品,而木质纤维素细胞壁的复杂多糖网络结构及其主要化学组分(如木质素、半纤维素、纤维素、果胶等)的交互作用,使其成为抵抗生物质降解的天然屏障,降低了生物质纤维素的可及性,进而影响木质纤维素生物质的酶解转化率。影响木质纤维素生物质可及性因素可分为直接因子和间接因子。直接因子即为纤维素的可及表面积(CASA),其是决定纤维素酶解性能的直接因素;间接因素包括化学组成(木质素,半纤维素,纤维素,乙酰基基团,胞壁蛋白等)、基质物理结构因素(孔隙率、孔径、粒径、比表面积等)以及纤维素本身结构因素(结晶度、聚合度等)。因此,准确定量分析纤维素可及度对于研究和强化木质纤维素的生物转化具有重要意义。然而,传统用于表征木质纤维素生物质可及表面积的分析方法还存在一些不足之处。其一,所用探针分子大小往往与纤维素酶分子大小相差较大,导致所测得的可及表面积与“真实值”存在较大偏差;其二,所用探针分子对底物识别特异性较差或无特异性识别;其三,通常底物需要干燥等处理,而干燥往往导致纤维素基质的孔隙结构发生变化。研究表明纤维二糖水解酶(CBHI)在底物降解过程中,其纤维素识别组件CBM可以特异性识别葡聚糖链还原端,并吸附于其表面进而开始降解底物。基于此,本论文进行了以下研究工作:1、以目前工业上生产纤维素酶的主要菌种,里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶关键组分纤维二糖水解酶(Cel7A)为模型,构建了绿色荧光素(FITC)标记的CBM探针分子及CBM与双绿色荧光蛋白(GFP)融合的荧光探针分子。2、将荧光探针分子应用于木质纤维素关键结构特性对可及度影响的定量分析,发现秸秆原料经过3%H2S04预处理可以一定程度上提高纤维素的可及度,从而提高纤维素的酶解糖化率。结合模型化合物对微晶纤维素酶解作用影响,发现木质素可特异性吸附纤维素酶,进而大幅度降低底物酶解转化率。此外,结合对细胞壁中木质素结构单体进行基因工程改造的拟南芥样品分析,发现将细胞壁中木质素单体突变为对羟苯基型结构可以有效降低细胞壁的抗降解特性,从而提高纤维素的可及度。3、尝试了从里氏木霉(Trichodermareesei)基因组分别获得外切葡聚糖酶CBHI,外切葡聚糖酶CBHII,内切葡聚糖酶,β-葡萄糖苷酶四种纤维素酶基因序列,利用毕赤酵母进行重组表达,并分别使用mCherry,红色荧光蛋白(RFP),绿色荧光蛋白(GFP),蓝色荧光蛋白(BFP)为报告基因重组构建异源表达质粒,旨在获得含有四种荧光蛋白标记的纤维素酶组分,以应用于木质纤维素生物质降解过程的可视化研究和纤维素酶协同作用分析。