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目的:研究浒苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide,EP)对四氯化碳所致肝损伤的保护作用。方法:1、以福建沿海产的浒苔为原料,采用纤维素酶法辅助提取,通过中性蛋白酶去蛋白质,通过DA201树脂去色素,通过透析袋去除盐类物质得到浒苔粗多糖(crude enteromorpha’s polysaccharide,CEP),将CEP用DEAE-52纤维素分离纯化,得到CEP主成分EPx。苯酚硫酸法测定多糖含量;硫酸钡比浊法测定多糖硫酸根含量。2、以人肝细胞L-02为实验对象,设置6个处理组:正常组(Normal),模型组(Model),EPx低、中、高剂量组(LEPx、MEPx、HEPx)及阳性对照组(Vitamin E,Vit E)。将细胞(2×105个/m L)接种于96/6孔板(96孔板用于CCK8法测细胞活性,6孔板用于生化指标测定),培养24 h后吸弃上清液,Model组添加含终浓度为15 mmol/L四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)的无血清RPMI-1640培养液;LEPx、MEPx、HEPx组同时加入EPx溶液使其浓度分别为10-8 g/m L、10-7 g/m L、10-6 g/m L;Vit E组同时加入终浓度50μmol/L的Vit E悬液;Normal组加入含有相同浓度DMSO的无血清RPMI-1640培养液。培养4 h后,CCK8法测各组细胞的存活率;吸取各组细胞上清液测其中谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)活性;收集各组细胞测定细胞谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;提取各组细胞总RNA测定GPx、Cu/Zn SOD基因表达量;提取各组细胞总蛋白检测细胞色素P450 2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)蛋白表达量。3、将72只雄性ICR小鼠随机分成6组:正常组(Normal),模型组(Model),CEP低、中、高剂量组(LCEP、MCEP、HCEP)及阳性对照组(Silymarin)。Normal组和Model组灌胃(Intragastric administration,ig)给予生理盐水;LCEP、MCEP、HCEP组分别ig给予150 mg/kg、300 mg/kg、450 mg/kg的CEP水溶液;Silymarin组给予100 mg/kg水飞蓟素水分散液,ig剂量均为10 m L/kg B.W。连续灌胃21 d,末次给药1 h后腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)0.1%CCl4橄榄油溶液,撤饲料,禁食不禁水16 h。眼球取血,测定血清中转氨酶活性;解剖分离肝脏,检测其中GPx、GST、SOD、MDA、GSH等生化指标,GPx、Cu/Zn SOD基因表达量以及CYP2E1蛋白表达量,并进行肝组织病理学检查。结果:1、浒苔多糖的制备及其分离纯化CEP为淡绿色粉末状固体,多糖含量为53.93%,硫酸根含量为16.42%,分离纯化后所得的EPx为白色粉末状固体,多糖含量为97.49%,硫酸根含量为21.93%。2、EPx对CCl4致人肝细胞L-02损伤的保护作用相比于Normal组,在15 mmol/L剂量的CCl4造模剂量下,Model组细胞存活率较低(P<0.01);细胞上清液ALT、AST酶活性较高(P<0.01);细胞匀浆液中SOD、GPx酶活性较低(P<0.01),GSH含量较少(P<0.01),MDA含量较多(P<0.01),CYP2E1蛋白表达量较高(P<0.01),Cu/Zn SOD、GPx基因表达量也较高(P<0.01)。与Model组相比,LEPx、MEPx、HEPx组细胞存活率均较高(P<0.05),其中MEPx细胞存活率最高;LEPx、MEPx、HEPx组细胞培养上清液中的ALT酶活性均较低(P<0.01),并随着EPx浓度的升高其降低程度越大,且其降低ALT活力值幅度超过了Vit E组的水平;而LEPx、MEPx、HEPx各组AST酶活性与Model相比差异无统计学意义(P>0.05)。EPx对GPx酶活性的影响远大于Vit E,并呈现剂量依赖关系,MEPx、HEPx组具有较高的GPx酶活性(P<0.05或P<0.01),而LEPx以及Vit E组对GPx酶活性与Model相比差异没有统计学意义(P>0.05);对于SOD酶活性,LEPx、MEPx、HEPx组均有较高的SOD酶活性(P<0.01),其中MEPx组SOD酶活性最大,Vit E组也显现出较高的SOD酶活性(P<0.05),但幅度小于EPx各组;对于GSH含量,LEPx、MEPx、HEPx各组细胞内GSH含量均较高(P<0.05),Vit E组的含量更多(P<0.01),并且接近正常水平(P>0.05);对于MDA含量,EPx各组均有较低的MDA含量(P<0.01),且呈现剂量依赖性,Vit E组也检测出较低的MDA含量(P<0.01),下降幅度较EPx各组略大。对于CYP2E1蛋白表达量,MEPx、HEPx组以及Vit E组均有较低的CYP2E1蛋白表达水平(P<0.01),且接近正常细胞的蛋白表达量(P>0.05)。而LEPx组CYP2E1蛋白表达量与Model相比差异不显著(P>0.05)。对于Cu/Zn SOD、GPx基因表达量,MEPx组具有较低的Cu/Zn SOD基因表达量,且差异具有统计学意义(P<0.05),而LEPx、HEPx组Cu/Zn SOD基因表达量和Model组相比差异不显著(P>0.05);LEPx组具有较低的GPx基因表达量(P<0.05),MEPx及HEPx组GPx基因表达量与Model组相比差异不显著(P>0.05);Vit E组有很高的Cu/Zn SOD及GPx基因表达量(P<0.01),并接近Normal组水平(P>0.05)。3、CEP对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用采用0.1%CCl4橄榄油溶液一次性腹腔注射后,与Normal组相比,Model组小鼠具有较大的肝脏系数(P<0.01),较高的血清ALT、AST酶活性(P<0.01);肝组织GPx、GST、SOD酶活性均较低(P<0.01),GSH含量较少(P<0.01),MDA含量较高(P<0.01);肝组织CYP2E1蛋白表达量较高(P<0.01);Cu/Zn SOD、GPx基因表达量也较高(P<0.01);肝组织病理学检查可见中央静脉周围较大范围内肝细胞有明显肿胀,呈气球样变性,细胞核消失或者固缩。与Model组相比,LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组均有较低的小鼠肝脏系数,但仅Silymarin组显示出较大的差异(P<0.05);LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组均有较低的小鼠血清ALT、AST酶活性(P<0.01),其中MCEP组降低幅度最大。对于小鼠肝组织GPx酶活性,LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组均有较高的GPx酶活性(P<0.05或P<0.01),其中MCEP组GPx酶活性最高,超过Silymarin组,且接近Normal组酶活性(P>0.05);对于GST酶活性,MCEP、HCEP组及Silymarin组均有较高的GST酶活性(P<0.01),其中HCEP组及Silymarin组GST酶活性超过了Normal组水平(P<0.05);对于SOD酶活性,LCEP、MCEP、HCEP各组均有较高的SOD酶活性(P<0.01),其中MCEP组酶活性最大,并且与Silymarin组相当(P>0.05);对于GSH含量,LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组含量均有较高(P<0.05或P<0.01),其中MCEP组GSH含量最大;对于MDA含量,LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组均有较低的MDA含量(P<0.01),并接近Normal组水平(P>0.05)。对于肝组织CYP2E1蛋白表达量,MCEP、HCEP组及Silymarin组均具有较低的CYP2E1蛋白的表达量(P<0.01);而LCEP组CYP2E1蛋白表达量与Model组相比差异不明显(P>0.05)。对于肝组织Cu/Zn SOD、GPx基因表达量,LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组Cu/Zn SOD及GPx基因表达量均较低(P<0.01),且接近Normal组水平(P>0.05)。肝组织切片镜下检查发现LCEP、MCEP、HCEP各组及Silymarin组小鼠肝脏病理较Model组均有一定程度好转,其中MCEP组表现最显著:肝小叶结构及肝细胞形态基本恢复正常,仅在中央静脉外周一圈偶可见稍增大淡染的肝细胞;其次为HCEP组及Silymarin组,LCEP组镜下改变略有好转。结论:1、酶法提取得到浒苔粗多糖CEP,对其进行分离纯化得到纯化多糖EPx,CEP与EPx多糖含量分别是53.93%和97.49%;硫酸根含量分别为16.42%和21.93%。2、EPx对CCl4所致人肝细胞L-02损伤具有保护作用,且作用效果优于Vit E。EPx能加强细胞内抗自由基的防御体系功能,降低脂质过氧化程度,明显增强细胞活性,保护细胞膜,降低细胞外转氨酶活性,并且抑制CYP2E1蛋白的表达。3、CEP对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有保护作用,其中300mg/kg CEP剂量组效果最好。CEP预处理能够明显改善肝脏病理改变,降低血清转氨酶活性,增强肝组织抗氧化能力,并抑制CYP2E1蛋白的表达,减少自由基的生成,保护组织免受其害。4、浒苔多糖发挥抗化学性肝损伤作用的机制可能与其抑制CYP2E1的过量表达,增强肝细胞抗氧化能力,加速清除自由基有关。