研究背景和目的胃癌是严重威胁全人类生存和健康的恶性肿瘤,亚洲是胃癌的高发地域之一,而我国的发病人数则居亚洲之首,在我国胃癌无论发病率还是死亡率均高居所有恶性肿瘤前三位。由于早期症状不明显和缺乏规范体检,临床上大部分患者胃癌确诊时已发生转移,导致患者不良预后。因此,探讨胃癌转移的分子机制,寻找有效的分子标志物,有望为胃癌转移的预测、诊断和治疗提供新的方向。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是肿瘤转移的重要机制之一,肿瘤细胞通过发生EMT,失去上皮极性而获得间质特性,伴随着上皮标志物如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白ZO-1等的缺失和间质标志物如波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)等的升高。肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)是指肿瘤中少部分具有自我更新、肿瘤起始和化疗抵抗特性的细胞群体,肿瘤干性(Stemness)即指的是这部分肿瘤细胞所拥有的特性,常见的干性标志物包括CD133、CD44、Sox2等。研究发现,EMT是驱动肿瘤细胞获得肿瘤干性的重要过程。通过发生EMT,肿瘤细胞可以获得更好运动、侵袭、转移能力和肿瘤干性潜能。EMT发生的机制错综复杂,肿瘤微环境与EMT的发生紧密相关,肿瘤微环境中的转化生长因子β(TGFβ)是最为重要的EMT促进因子,可通过经典的Smad通路形成转录复合体调控EMT，也可调控非Smad依赖的信号通路如PI3K/AKT通路、MAPK通路、NF-kB通路等,介导EMT。因此,深入阐明TGFβ介导EMT的分子机制,有望为阻断EMT、治疗肿瘤转移提供新策略。MicroRNA(miRNA)是非编码RNA家族成员,长度介于19~25核苷酸,研究发现人类基因组中有一半以上的编码基因受microRNA调控,在增殖、侵袭、血管生成、凋亡等多种生物行为中扮演重要角色。前期研究结果证实microRNA可以调控EMT，并且可以作为TGFβ的下游效应分子,参与其生物学行为的发生。MiR-577是近年发现的肿瘤相关基因,在胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌等多种肿瘤中异常表达,但迄今为止,miR-577在胃癌的表达水平、生物学功能和调控的分子机制仍不清楚。通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析,我们发现miR-577在胃癌中明显上调,体内体外的实验研究证实miR-577促进胃癌侵袭、转移、EMT和肿瘤干性,但不影响胃癌增殖。通过多种细胞因子筛选,我们发现TGFβ显著诱导miR-577的表达,通过转录组学分析证实NF-kB P65是miR-577的转录因子,TGFβ通过活化NF-kB,磷酸化P65,入核转录调控miR-577的表达。通过生物信息分析和实验验证,我们证实SDPR蛋白为miR-577的下游靶基因,SDPR通过直接与ERK结合,抑制ERK磷酸化,影响ERK-IKKα/β-IKBα-P65通路,从而抑制P65磷酸化,正反馈抑制miR-577的转录。结合生物信息分析和实验验证,我们发现miR-577及其靶基因SDPR是TGFβ介导EMT的重要机制,通过正反馈环路促进胃癌转移,本研究拟探讨miR-577及其靶基因如何参与TGFβ介导的EMT，为未来针对miR-577和SDPR为靶点实现精准治疗提供实验依据。研究方法1.miR-577在胃癌细胞、组织和临床标本的表达水平(1)通过对 TCGA STAD(The Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma)数据库microRNA芯片进行分析,筛选胃癌差异microRNAs，miR-577是差异基因之一并在胃癌中高表达。(2)采用荧光定量RT-PCR检测36例新鲜胃癌组织标本及其配对的癌旁正常黏膜组织,7 株胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MGC803、MGC823、BGC823、BGC803、MKN45)和正常永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1中miR-577的表达。(3)通过对153例有完整随访资料的胃癌石蜡标本进行原位杂交,分析miR-577的表达与临床病理学参数以及患者预后的关系。2.miR-577对胃癌细胞体内外生物学特性的影响(1)通过转染miR-577 AgomiR/AntagomiR用于miR-577的过表达和干扰,通过MTT实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验等检测miR-577在体外对胃癌细胞增殖能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞,裸鼠皮下瘤注射实验检测miR-577在体内对胃癌细胞增殖的影响。(2)瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后,Transwell细胞迁移实验检测miR-577体外对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞,裸鼠尾静脉瘤细胞注射实验检测体内miR-577对胃癌细胞肺定殖能力的影响以及分析与裸鼠生存预后的关系。(3)瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后,干性成球实验检测miR-577对胃癌细胞成球能力的改变;MTT实验检测miR-577对奥沙利铂化疗敏感性的影响;将细胞分为NC组、miR-577组、NC+奥沙利铂组、miR-577+奥沙利铂组,通过流式细胞技术检测miR-577对凋亡的影响,并通过Western Blot检测凋亡相关指标的改变。3.miR-577参与TGFβ介导EMT的机制研究(1)倒置显微镜观察瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后胃癌细胞形态的变化,利用Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测EMT和肿瘤干性相关标志物的变化。(2)使用TGFβ刺激胃癌细胞OH、24H、48H,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。(3)将细胞分为TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+ AntagomiR处理组,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变。(4)使用基因组学网站UCSC和转录因子数据库PROMO分析发现NF-κBP65是miR-577的转录因子,存在A、B、C3个结合位点,TGFβ刺激胃癌细胞OH和24H，Western blot检测NF-κB P65磷酸化改变,免疫荧光观察NF-κB P65定位的改变。(5)使用 NF-κB 通路抑制剂 QNZ 和 BAY 11-7082,Western Blot 检测 P-P65 和P65的表达,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化;设计特异性siRNA干扰NF-κB P65,Western Blot检测P65变化,荧光定量RT-PCR检miR-577的表达变化。(6)构建启动子荧光素酶报告基因载体,分组为PGL4+P65组、WT+P65组、MUTAB+ P65 组、MUTAC+ P65 组、MUTBC+ P65 组、MUTABC+ P65 组,检测荧光素酶活性变化;根据A、B、C 3个位点设计特异性探针,CHIP实验验证NF-κB P65与启动子区位点直接结合。4.miR-577靶基因的筛选和鉴定(1)通过靶基因数据库miRDB、PITA、RNA22和Targetscan分析miR-577潜在调控的靶基因,TCGA分析靶基因在胃癌中的表达水平及其相应的表达丰度;荧光定量RT-PCR分析过表达miR-577后靶基因的变化;构建靶基因3’UTR区域双荧光素酶载体,验证miR-577与靶基因3’UTR区直接结合。(2)荧光定量RT-PCR分析选定的靶基因SDPR在30例胃癌新鲜临床组织标本及其癌旁配对正常胃粘膜组织中的表达,并分析SDPR与miR-577表达在新鲜组织水平的相关性。(3)对153例有完整随访资料的石蜡包埋胃癌组织进行SDPR免疫组化染色,分析SDPR与临床病理参数和患者预后的关系。(4)设计特异性siRNA干扰SDPR,构建SDPR过表达载体,倒置显微镜观察形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变;(5)免疫荧光共染SDPR和ERK，CO-IP验证SDPR与ERK相互作用,Western Blot检测ERK/NF-κB通路指标的改变。(6)过表达和干扰SDPR,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。(7)具体分组为 Mock 组、NC 组、miR-577 组、miR-577+SDPR 组,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化，Western Blot检测EMT标志物和ERK/NF-κB通路指标的改变;5.统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。MiR-577在新鲜配对胃癌组织中的表达采用配对样本Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon rank-sum test),Ⅰ+Ⅱ分期与Ⅲ+Ⅴ分期中miR-577的表达以及转移组(M1)与非转移组(MO)中miR-577的表达采用独立样本 Kruskal-Wallis 检验(Kruskal-Wallis test);MiR-577 和SDPR的表达与临床病理参数之间的相关性采用卡方检验(Pearson’s chi-squared(x2)test);miR-577和SDPR与患者预后分析采用Kaplan-Meier法绘制并进行Log-Rank检验比较生存曲线之间的统计学差异;Transwell细胞迁移实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验、裸鼠皮下成瘤实验等进行两组间的均数比较时,采用两独立样本的t检验,进行多组间的均数比较时采用单因素方差分析(One-WayANOVA),方差分析前先进行Levene法检测方差齐性,方差齐时多重比较使用LSD法(Least-significant Difference，最小方差法),方差不齐时使用 Dunnett’s T3 法。研究结果:1.miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达(1)TCGA芯片分析提示miR-577在胃癌高表达通过对TCGA胃癌microRNA芯片进行分析,在42对胃癌及其配对的癌旁正常组织中,有29对癌组织中miR-577表达上调。(2)miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达通过对36对胃癌及其癌旁配对正常组织进行荧光定量RT-PCR检测,发现与癌旁正常组织相比,miR-577在胃癌组织中表达上调,并且肿瘤分期为Ⅲ+Ⅳ胃癌患者组织较Ⅰ+Ⅱ期中的miR-577表达更高,转移组(M1)较非转移组(MO)的miR-577表达也更高。细胞水平上,较永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1,miR-577在6株胃癌细胞中的表达均上调。(3)miR-577在胃癌临床标本高表达并与不良预后相关通过原位杂交检测153例有完整随访资料的胃癌石蜡包埋组织,也证实miR-577在胃癌中高表达,与TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移数、远处转移等病理参数相关,并且与Ⅰ-Ⅲ期患者的DFS以及IV期患者的OS相关。以上实验说明,miR-577在胃癌中高表达,并与患者转移和不良预后相关,可能是评估胃癌患者转移和预后的作为独立预测指标。2.miR-577不影响增殖但促进转移和化疗耐药(1)miR-577体内体外均不影响胃癌增殖过表达和干扰miR-577后,MTT实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验均证实miR-577体外不影响肿瘤细胞增殖;构建稳定过表达miR-577细胞系,体内研究证实miR-577也与肿瘤细胞增殖无关。(2)miR-577体内体外促进胃癌转移体外过表达miR-577后,Transwell细胞迁移实验证实miR-577促进迁移和侵袭能力;干扰miR-577后,胃癌细胞的迁移和侵袭能力则明显下降。裸鼠尾静脉注射实验发现稳定过表达miR-577后,肿瘤的肺定殖能力增加,裸鼠的预后更差。(3)miR-577促进胃癌干性和奥沙利铂耐药过表达或干扰miR-577后,干性成球实验证实过表达miR-577后成球数目更多,干扰则减少。MTT结果证实过表达miR-577增加胃癌细胞MGC803对奥沙利铂的耐受性,干扰则提高MKN45细胞的化疗敏感性。流式细胞技术提示过表达miR-577可以显著抑制奥沙利铂诱导的凋亡,Western Blot结果提示过表达miR-577 后凋亡标志物 Cleaved-caspase3 和 Cleaved-caspase7 均减少。以上实验说明,miR-577不影响胃癌细胞增殖能力,但促进胃癌细胞体内外迁移、侵袭、肺定殖能力、成球能力和化疗抵抗能力。3.miR-577参与TGFβ诱导的EMT和肿瘤干性(1)miR-577促进胃癌EMT和肿瘤干性在MGC803细胞中过表达miR-577后,细胞变得更为长梭,在MKN45细胞中干扰miR-577,细胞则向椭圆形转化。Western Blot结果显示过表达miR-577后,上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,而干扰miR-577后则得到相反的结果。免疫荧光结果提示,过表达miR-577上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin上调,干扰则为相反的效应。(2)miR-577能被TGFβ诱导表达使用TGFβ刺激胃癌细胞OH、24H、48H后,细胞形态由椭圆形逐渐向长梭形转变,生出细胞伪足,同时细胞迁移能力升高,Western Blot结果显示上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,提示TGFβ诱导胃癌EMT和肿瘤干性,荧光定量RT-PCR结果发现TGFβ刺激明显升高miR-577,并呈现时间依赖性。(3)干扰miR-577逆转TGFβ诱导的EMT和肿瘤干性TGFβ刺激后再干扰miR-577,倒置显微镜观察发现TGFβ诱导的长梭形又重新向椭圆形转变,细胞的迁移能力也得到恢复,TGFβ抑制的上皮标志物E-cadherin 被干扰 miR-577 回复,TGFβ 促进的间质标志物 Vimentin、N-cadherin、MMP9和肿瘤干性标志物CD44、SOX2被干扰miR-577逆转。(4)TGFβ诱导的NF-kB P65入核通过转录组学分析发现NF-kB P65可能是miR-577的转录因子,存在3个潜在结合位点。文献报道TGFβ可以诱导NF-kB P65入核,通过Western Blot发现TGFβ刺激时间依赖性的磷酸化P65,免疫荧光观察NF-kB P65的定位,发现TGFβ刺激后,NF-kB P65核定位比例明显提高。(5)抑制和干扰NF-kB P65抑制miR-577表达使用NF-kB通路抑制剂QNZ和BAY 11-7082刺激细胞后,P65磷酸化水平降低,荧光定量RT-PCR检测发现miR-577表达下降;设计特异性siRNA干扰NF-kB P65后,miR-577的表达也显著下调。(6)NF-kB P65直接转录调节miR-577根据A、B、C 3个结合位点,设计荧光素酶报告基因载体,启动子荧光素酶报告基因实验发现A、B、C 3个结合位点均能提高荧光素酶活性,CHIP实验也证实MGC803和MKN45细胞中,NF-kB P65均能与A、B、C 3个结合位点结合。该部分研究结果说明miR-577是TGFβ的新靶点,TGFβ通过调控NF-kB P65核转位,转录水平调控miR-577的表达,介导肿瘤EMT和肿瘤干性。4.SDPR是miR-577的下游靶基因(1)SDPR是miR-577的候选靶基因通过miRDB、PITA、RNA22和Targetscan 4个数据库结合,筛选出104个候选靶基因,再通过TCGA寻找胃癌下调的基因,并限定表达丰度不低于2,最终选定 7 个候选基因:LM07、CCDC68、KLF9、Smad4、KLF4、KAT6B 和SDPR,过表达miR-577后荧光定量RT-PCR发现SDPR下调最为明显。双荧光素酶报告基因实验证实miR-577与SDPR的3’UTR区域的2个位点均有直接结合。(2)SDPR在胃癌组织中低表达并且与miR-577负相关通过30对胃癌及其配对的癌旁正常组织进行荧光定量RT-PCR检测发现SDPR在胃癌中低表达(P<0.05)，且Ⅲ+Ⅳ期患者中SDPR表达比Ⅰ+Ⅱ期患者更低(P<0.01),统计分析发现miR-577和SDPR在新鲜胃癌组织中的表达水平呈负相关(R=-0.442,P=0.015)。(3)SDPR在临床标本中低表达并与良性预后相关对153例有完整随访资料的石蜡包埋胃癌组织进行SDPR免疫组化染色,也发现较正常胃粘膜组织,SDPR在肿瘤中表达更低,并且随着肿瘤分期增加,表达更低。统计分析也发现miR-577高表达的胃癌组织,SDPR表达更低。Ⅰ-Ⅲ期患者DFS分析和Ⅳ期患者OS分析发现SDPR高表达与患者良性预后相关。协同分析发现miR-577高表达+SDPR低表达组预后最差,miR-577低表达+SDPR高表达预后最好。(4)SDPR抑制EMT、肿瘤干性和肿瘤转移在MGC803细胞中干扰SDPR后,细胞形态变为长梭的针刺状,细胞的迁移和侵袭能力增加,成球能力变强,Western Blot结果显示上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,提示干扰SDPR促进EMT、肿瘤干性和肿瘤转移。而通过载体介导的SDPR过表达则得到相反的趋势。(5)SDPR 抑制 ERK/NF-κB 通路。免疫荧光共染SDPR和ERK,发现二者存在明显的共定位,CO-IP实验证实二者存在直接结合作用,干扰SDPR后ERK磷酸化升高,IKKα/β磷酸化增加、IKBα磷酸化增加、P65磷酸化增加,提示SDPR抑制ERK/NF-κB通路。(6)SDPR调控ERK/NF-κB通路正反馈环路抑制miR-577表达前面证实NF-κB P65是miR-577的直接转录因子,而SDPR又抑制ERK/NF-κB通路,提示可能存在正反馈环路。荧光定量RT-PCR结果显示干扰SDPR促进miR-577的表达,过表达SDPR则抑制miR-577的表达。(7)恢复SDPR表达逆转miR-577诱导的EMTTranswell实验显示过表达miR-577促进胃癌细胞迁移能力,而过表达miR-577后恢复SDPR的表达则逆转miR-577上调的细胞迁移力;Western Blot结果显示过表达miR-577后间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,恢复SDPR表达则逆转miR-577对间质标志物和干性标志物的促进。同样,通过Western Blot检测ERK/NF-kB通路也得到同样的结论。该部分实验说明SDPR作为miR-577的靶基因,在胃癌细胞中通过与ERK直接结合,抑制ERK磷酸化,抑制ERK/NF-kB通路,一方面抑制EMT和干性,另一方面则抑制miR-577的转录,通过正反馈环路调节miR-577的表达。结论1、miR-577在胃癌中高表达,与肿瘤转移和不良预后相关,可能扮演癌基因角色;2、miR-577不影响胃癌增殖但促进胃癌细胞体内体外的迁移、侵袭和肺定殖能力;3、TGFβ通过NF-kB转录调节miR-577,介导EMT和胃癌干性;4、SDPR是miR-577的下游靶基因,调控ERK/NF-kB通路,一方面抑制EMT和肿瘤干性,另一方面正反馈调节miR-577的表达。