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iNOS基因与原发性高血压的关联及功能鉴定前言原发性高血压(Essential Hypertension，EH)是一种严重威胁人类生存健康的常见复杂疾病，以该病为主要危险因素的心脑血管疾病在许多发达国家及发展中国家均居致死性疾病的首位。一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)产生的一种自由基性质的气体，它带有不成对的电子，容易弥散通过细胞膜，具有舒张血管，抗血小板和白细胞黏附与聚集，维持血管内皮的完整性，调节细胞的增殖和凋亡等广泛的功能，还可以起到生物信使和神经递质的作用。iNOS基因由26个外显子构成，其调控过程十分复杂，基因功能主要在转录水平上进行调控。为了探讨iNOS基因在EH发生中的作用，本研究联合采用了基因扫描的连锁分析和候选基因的关联研究两种研究策略，在高血压高发区选择高血压家系通过连锁分析确定iNOS基因是否是该人群高血压的易感基因，并选择iNOS启动子区rSNP—1026C／A位点与EH进行关联分析。在此基础上，利用软件预测、报告基因活性检测和EMSA等方法分析iNOS基因的启动子功能，对其中rSNP—1026C／A位点进行了功能鉴定，以明确iNOS基因在EH致病机制中的作用。材料与方法一、实验材料：1、人类肝癌Bel细胞2、STR基因分型相关试剂3、Real-time PCR相关试剂4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂6、Westem印迹杂交相关试剂二、实验方法：1、从辽宁省彰武县高血压高发区汉族人群，收集67个原发性高血压家系，在高血压热点候选区域17qcen-17q11.1和17q21-17q22区域内分别选择D17S1878位点和D17S932位点。在ABI PRISMTM 310型遗传分析仪上用GeneScan Analysis2.02软件进行基因型自动分析，应用受累同胞对方法进行连锁分析。2、在该研究人群中随机选取高血压患者和正常对照共计610人进行病例一对照研究。选择iNOS—1026C／A SNP位点，应用Real-time PCR仪进行基因分型，统计分析其与EH的关联性；并按年龄分层分析其与EH的关联性。应用非条件Logistic多因素分析，排除其它危险因素的干扰。3、PCR克隆构建iNOS启动子区的—1026C与—1026A两种基因型的萤光素酶报告基因表达载体，脂质体法转染人肝癌Bel细胞，应用萤光素酶试剂盒检测萤光素酶活性，鉴定不同基因型的iNOS启动子的活性。4、电泳泳动迁移分析(EMSA)鉴定iNOS启动子区顺式作用元件，合成-1026C／A位点的寡核苷酸，经复性和末端标记后与Bel细胞核提取物结合，YY1特异性抗体竞争实验用于判断特异性结合带；染色质免疫沉淀(ChIP)在体内条件下鉴定iNOS启动子区顺式作用元件。5、利用不同浓度脂多糖(LPS)刺激细胞的YY1信号通路，应用Westem印迹杂交检测核转录因子YY1的蛋白表达量。结果1、家系研究资料表明，年龄较大、饮酒、性格急躁者易患高血压，BMI、甘油三酯等也是高血压的危险因素；病例对照研究资料表明，年龄、甘油三酯、BMI是该人群高血压发生的弱危险因素。2、受累同胞对连锁分析结果显示，D17S1878和D17S932的t值分别为1.88和3.95，P＜0.05，说明受累同胞对随机共享这两个位点的相同等位基因的比例高于预期的25％。3、病例对照的关联分析表明，iNOS—1026C／A位点的基因型频率在高血压组和正常对照组之间分布存在统计学显著性意义(x~2=72.45，P=0.00)；按年龄分层分析显示，40～、50～、60～年龄亚组中，iNOS—1026C／A位点与EH显著关联。经过非条件Logistic多因素分析，基因型AA相对于基因型CA+CC的OR值为0.129，95％CI为0.053～0.318，是EH的强保护因子。4、不同基因型载体萤光素酶活性检测结果显示pGL3—1026A和pGL3—1026C的活性均高于pGL3—basic，并且pGL3—1026A的活性高于pGL3—1026C的活性。5、对iNOS启动子区分析发现，—1026C／A位点改变了转录因子YY1的结合位点，EMSA的结果发现—1026C可以与转录因子YY1结合。ChIP的结果进一步证实在活细胞内这一结合作用的存在。6、萤光素酶分析和EMSA的实验结果表明，LPS可以增强iNOS的YY1反应元件与转录因子YY1的结合能力。Western印迹杂交结果显示，LPS可以使YY1蛋白的表达量增加。结论1、本研究的高血压高发人群中，17qcen-17q 11.1和17q 21-17q 22区域内的STR位点D17S1878和D17S932附近存在EH易感基因。2、iNOS—1026C／A位点与EH存在关联，基因型AA可能在EH发生中起保护作用。3、iNOS—1026C／A位点是功能性SNP位点，通过改变与转录因子YY1的结合发挥功能性位点的作用。4、LPS通过提高转录因子YY1的蛋白表达量，增强YY1结合反应元件的亲和力，改变iNOS基因启动子的活性。