神经元N受体（neuronal nicotinic acetylcholine receptors, NNRs）是由至少12种亚基（α2 ?α10,β2 ?β4）通过不同搭配组成的五聚体,理论上可组成的亚型种类众多,并且不同亚型分布有别,电生理学特性各异,由此形成丰富而复杂的功能特征。近年来,NNRs由于其在高级脑功能中所扮演的角色,以及与神经退行性疾病等多种病理状态的相关性,已成为药物研究中的重要靶标。深入研究NNRs不同亚型的电生理学特征,不仅有助于对不同生理和病理状态下胆碱能信号传递在时间、空间和强度上变化规律的认识,也对靶向胆碱能神经系统功能紊乱相关疾病的药物研究大有裨益。宾赛克嗪是本实验室发展的一种兼具抗M和抗N作用的速效强效有机磷毒物（orgnaophosphorus, OP）抗毒剂。前期研究发现:1、在OP中毒过程中,NNRs失敏后并非如传统观点所言处于一种无功能状态,而是能够通过易化M受体对激动剂的敏感性而增强OP的毒性作用,这为宾赛克嗪抗N作用研究的重要性提供了理论依据;2、前期在配体结合实验中发现宾赛克嗪对M受体的亲和力远弱于阿托品,而在动物抗致死实验中发现宾赛克嗪作用强于阿托品,这为宾赛克嗪抗N作用研究的重要性提供了实验依据。因此,研究宾赛克嗪对NNRs的拮抗特征不仅对于阐明其抗毒分子机制及优化新一代抗毒剂的研发具有重要意义,同时也可能为其它胆碱能神经系统功能紊乱相关疾病提供新的干预策略。在上述理论依据与实验依据的基础上,本课题采用膜片钳全细胞记录技术,在转染表达脑内分布最广、表达最多的α4β2亚型,与学习记忆等高级脑功能密切相关的α7亚型以及在很多重要脑区均有丰富表达的α4β4亚型这三种具有代表性的NNRs亚型的SH-EP1细胞株上,首先研究NNRs三种亚型不同功能状态的电生理学特征,并在此基础上重点评价新型胆碱受体拮抗剂宾赛克嗪对该三种NNRs亚型拮抗作用的药理学特征,探讨其在三种受体亚型上可能的作用位点,最后在最主要的NNRs亚型α4β2上探索性的尝试一种新的胆碱能药物评价方法,即考察药物对NNRs不同功能状态的影响。上述研究获得的主要结果如下:一、SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型不同功能状态的电生理学研究本部分研究旨在建立NNRs不同亚型不同功能状态的电生理学研究技术平台,在此基础上对比性研究NNRsα4β2、α4β4和α7三种亚型多种功能状态的电生理学特点,为此平台用于药物评价及其作用机制的研究奠定基础。1.转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型SH-EP1细胞株的鉴定首先在本实验条件下建立了SH-EP1细胞株的传代培养方法,其形态学特征与文献报道一致;其次通过RT-PCR实验证实了上述三种细胞株分别表达相应N受体亚基的mRNA;最后通过N受体特异性激动剂在三种细胞株上分别诱发出相应受体亚型介导的内向电流,各亚型电流特征均与文献报道一致,表明细胞株表达了具有功能的上述受体亚型。2.神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的电生理学特征三种受体亚型激活态所介导的内向电流均能被快速激活,但随时间的动力学变化过程不同。其中,α7激活速度最快,失活最快;α4β4激活最慢,几乎不失活;α4β2激活速度居中,失活呈先快后慢两个衰减相。向细胞表面喷射不同浓度的相应激动剂,发现三种亚型的电流幅度均逐渐增大,具有激动剂浓度依赖性。三种亚型上相应激动剂的EC50分别为:α4β2:烟碱3.1±0.7μmol/L;α4β4:烟碱1.1±0.6μmol/L;α7:胆碱814. 6±209.0μmol/L。三种亚型激活态的内向电流均具有电压依赖性和内向整流特性。其中,α4β2和α7激活态介导的内向电流内向整流完全,而α4β4虽具有内向整流趋势,但并不完全。进一步统计表明α7的内向整流趋势最强,α4β4最弱,α4β2居中。上述结果提示,在激动剂作用下神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的形成和转变各具特点,但其介导的内向电流均具有浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性。3.神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型失敏态的电生理学特征持续给予激动剂4 s可诱发出细胞株上相应NNRs亚型的内向电流,但三种亚型的失敏速度和程度均不同。其中,α7失敏最快,程度最深;α4β4失敏最慢,程度最浅;α4β2失敏速度及程度均居中。反复给予激动剂时,每两次给药间隔3 min,可观察到三种亚型在激动剂反复作用下失敏的规律有所不同。其中,α4β2电流幅度随给药次数的增加而迅速减小,但自第3次给药起失敏趋势减缓;α4β4和α7电流基本不随给药次数的增加而进行性失敏。上述结果提示,神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型在激动剂持续或反复作用下功能失敏过程各不相同,这可能与它们在有机磷毒物中毒时过度蓄积的乙酰胆碱持续作用、烟草成瘾时烟碱反复作用所介导的不同效应有关。4.神经元N受体α4β2亚型功能失敏后再激活态的电生理学特征本部分研究在α4β2上发现了高浓度激动剂作用下受体失敏后再激活的现象。细胞膜电位钳制在?60 mV,当烟碱浓度低于100μmol/L时,α4β2电流快速激活达到峰值后,呈先快后慢的双相失敏过程。但在烟碱浓度高达1 mmol/L时,电流在激动剂持续作用下迅速失敏至基线附近后当激动剂去除时可再次记录到一内向电流。这提示神经元N受体在不同功能状态间的转化是一个十分复杂的过程,不同状态可能在有机磷中毒过程中发挥不同作用。二、宾赛克嗪拮抗SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型的药理学特征第一部分建立的NNRs不同亚型不同功能状态的电生理学研究技术平台上,本部分重点研究了宾赛克嗪对NNRsα4β2、α4β4和α7三种亚型的作用特征及分子机制。为探讨其可能的作用位点,研究内容包括了宾赛克嗪对三种亚型失敏的影响、抑制作用的电压依赖性和使用依赖性。1.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流的阻断作用本部分中,观察指标为Ip（峰电流,反映受体对激动剂反应幅度的大小）、Is/Ip （稳态电流和峰电流比值,反映电流衰减的程度）和Tau （衰减时间常数,反映电流衰减速度）。研究发现宾赛克嗪对上述三种NNRs亚型均具有明确的抑制作用。对于3μmol/L烟碱诱发的α4β2电流,1μmol/L烟碱诱发的α4β4电流和10 mmol/L胆碱诱发的α7电流,宾赛克嗪对Ip抑制作用的IC50分别为4.9、7.5和92.2μmol/L;对Is/Ip抑制作用的IC50分别为0.8、0.5和18.7 mmol/L;对Tau抑制作用的IC50分别为1009.7、0.42和1.08μmol/L。2.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的可逆性宾赛克嗪对NNRs三种亚型的抑制作用均具有可逆性。宾赛克嗪100μmol/L对α4β2、α4β4和α7三种亚型作用后第3、10、20 min分别测量电流峰值,可见其恢复速度较快。药物洗脱3 min后,三种亚型电流峰值可分别恢复至宾赛克嗪作用前的89.6±6.2、80.4±8.3、86.3±12.0%;20 min后,α4β4和α7可完全恢复,α4β2可恢复至89.2±3.5%。3.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的电压依赖性细胞膜电位分别钳制在?120、?90、?60、?30和0 mV下,观察宾赛克嗪对α4β2、α4β4和α7三种亚型介导电流峰值的抑制作用。研究发现,宾赛克嗪100μmol/L在?30和0 mV下对α4β2和α4β4的抑制作用与?120 mV下的相比较具有统计学差异,而在各钳制电位下对α7的作用之间均无显著性差异。表明宾赛克嗪对α4β2和α4β4的抑制作用具有电压依赖性,而对α7的抑制作用不具有电压依赖性。4.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的使用依赖性本部分实验设计了两组不同的给药程序以观察宾赛克嗪对α4β2、α4β4和α7三种亚型抑制作用的使用依赖性。一组持续给予宾赛克嗪100μmol/L条件下,每间隔3 min给予激动剂诱发一次电流,共4次（0,3,6,9 min）;另一组相同条件下每间隔3 min诱发一次电流,共2次（0, 9 min）。比较两组中第9 min电流峰值的大小。研究发现α4β2和α4β4两种亚型上述两组结果有统计学差异,α7则无。表明宾赛克嗪对α4β2和α4β4的抑制作用具有使用依赖性,而对α7的抑制作用不具有使用依赖性。三、宾赛克嗪拮抗SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2亚型不同功能状态的药理学特征第二部分中,我们采用国际公认的实验设计研究了宾赛克嗪对三种代表性NNRs亚型的拮抗特征并判断了其在不同亚型上可能的作用位点。本部分研究则探索性的尝试了一种新的胆碱能药物作用评价方法:我们在中枢分布最广、表达最丰富的α4β2亚型上侧重考察了宾赛克嗪对其不同功能状态的影响,考察内容包括宾赛克嗪对α4β2亚型激活态、失敏态和再激活态的作用特征。期望通过本部分的研究探索一种描述抗毒剂作用特点的新思路,也为靶向NNRs的药物研究提供新的可能策略。1.宾赛克嗪对α4β2受体静息态的拮抗作用本研究发现,100μmol/L宾赛克嗪与3μmol/L烟碱同时给予,对静息态α4β2受体向激活态转化的抑制可达91.8±3.4 % （n = 5）。宾赛克嗪的该抑制作用具有浓度依赖性,其IC50 = 4.9μmol/L。2.宾赛克嗪对α4β2受体失敏态的拮抗作用本研究还观察了由于被宾赛克嗪阻断而不能由激活态转变为失敏态的受体数量变化,即宾赛克嗪对受体失敏态的拮抗作用。研究发现,0.1μmol/L宾赛克嗪与3μmol/L烟碱同时给予,对失敏态α4β2的抑制可达9.7±4.1 % （n = 5）。并根据宾赛克嗪作用前（标识为灰色）后（标识为黑色）电流图形的对比分析,推导出宾赛克嗪对失敏态受体阻断作用的动力学过程,其函数形式为: N_open-blocked / N_activated = [(A₁e^-t/τ₁ + A₂e^-t/τ₂ + C₁)-(A₃e^-t/τ₃ + A₄e^-t/τ₄ + C₂)] / I_P (N_open-blocked,失敏态受体阻断数量;N_activated,激活受体总数量;A₁,灰色电流快成分;A₂,灰色电流慢成分;A₃,黑色电流快成分;A₄,黑色电流慢成分;τ₁,灰色电流快衰减常数;τ₂,灰色电流慢衰减常数;τ₃,黑色电流快衰减常数;τ₄,黑色电流慢衰减常数;C₁,灰色电流非衰减参数;C₂,黑色电流非衰减参数;IP,灰（黑）色电流峰值。3.宾赛克嗪对α4β2受体失敏后再激活过程的影响针对第一部分研究中发现的高浓度激动剂作用下受体失敏后再激活的现象,本研究进一步考察了宾赛克嗪对该再激活状态的作用。实验中通过1 mmol/L烟碱持续作用4 s诱发一快速激活后快速失敏至基线附近的内向电流,当烟碱给药结束时,可再次记录到一内向电流,该激活和再激活的电流均可被100μmol/L浓度宾赛克嗪所阻断。宾赛克嗪与烟碱同时给予时,受体激活后电流幅度降为单独给予烟碱时的（56±8）% （P < 0.05, n = 4）,而当给药停止时,再激活电流不再出现。表明宾赛克嗪可拮抗α4β2激活后再激活的功能状态。综上所述,本研究结论如下:1.NNRsα4β2、α4β4和α7三种亚型的激活态均具有激动剂浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性,但具有不同的开放动力学过程,其在激动剂持续和反复作用下的失敏特性也各不相同。2.宾赛克嗪对NNRsα4β2、α4β4和α7三种亚型均具有可逆性抑制作用。其中,对α4β2、α4β4抑制作用较强,该抑制作用加速其失敏,具有电压依赖性和使用依赖性,其作用位点可能在通道内部,机制可能为开放通道阻断作用;对α7抑制作用较弱,该抑制作用加速其失敏,但不具有电压依赖性和使用依赖性,其作用位点可能在通道外部远离细胞膜的非激动剂结合位点,机制可能为变构调节。3.宾赛克嗪对NNRs最主要的亚型α4β2的静息态、激活态、失敏态和再激活态均具有拮抗作用。