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本文对IL-37通过诱导Smad3磷酸化信号转换抑制肝癌细胞增殖的机制进行了研究。本研究分为三个部分： 第一部分：IL-37基因慢病毒表达载体的构建与鉴定。 目的：构建携带IL-37基因的重组慢病毒载体GV358-IL-37，为后续体内外相关实验奠定基础。 方法：PCR扩增IL-37基因片段后，定向连接至已酶切线性化的慢病毒载体，获得IL-37重组慢病毒GV358-IL-37并转换细菌感受态细胞；对阳性克隆菌落行PCR鉴定；对重组质粒测序并转染入293T细胞，倒置荧光显微镜下观察GFP表达，Western-blot检测目的基因表达；最后将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装，药筛法检测病毒滴度。 结果：将目的基因片段行PCR扩增后连接至线性化表达载体，阳性转换子PCR产物大小：849 bp，阴性转换子PCR产物大小：185 bp，测序结果示：阳性克隆与目的基因序列完全一致；将GV358-IL-37重组质粒转染293T细胞后，细胞内可观察到明显的绿色荧光，经Western Blot检测可观察到30 kDa附近有特征条带，大小与目的基因相吻合；包装慢病毒48小时后提取并浓缩慢病毒，药筛法测得病毒滴度为9E+5 TU/ml。 结论：将IL-37基因与酶切后的慢病毒载体GV358进行定向连接，成功构建出含有IL-37基因编码序列的重组慢病毒载体GV358-IL-37；将其转染入293T细胞，行Western Blot检测目的蛋白表达，结果显示目的基因IL-37可成功表达；最后通过慢病毒包装系统，成功获得滴度为9E+5 TU/ml的重组慢病毒，为后续体内外相关实验奠定基础。 第二部分：IL-37在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖的影响并初步探讨其分子机制。 目的：观察IL-37在人HCC细胞中的表达水平与HCC临床病理特征、预后的相关性，分析调控IL-37的表达对HCC细胞增殖的影响，并初步探讨其潜在的分子机制。 方法：收集101例HCC新鲜组织标本，经Real-time qPCR和IHC检测癌组织及其对应癌旁组织中IL-37的表达水平，并用Spearman秩相关分析、Kaplan-Meier生存曲线、COX回归分析IL-37表达与HCC临床病理特征、预后的相关性；Real-time qPCR和Western-blot检测正常肝细胞系LO2，QSG-7701与HCC细胞系SMMC-7721，HepG2，Huh7， MHCC-97H的IL-37表达水平的差异；在HCC细胞中过表达IL-37和SiRNA沉默IL-37的表达，CCK-8和克隆形成实验观察IL-37对HCC细胞增殖的影响；用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡，PI染色检测细胞周期，经流式细胞仪分析结果；Western-blot检测c-myc，p21， cyclinB1，cdc2，cyclinA2，cyclinD1的表达。 结果：在101对HCC组织中有85对（85.15％) IL-37的表达水平低于对应癌旁组织；IHC分析101例HCC组织IL-37表达水平，根据染色结果分为高表达组（n=50)和低表达组（n=51)；Spearman秩相关分析示：IL-37的表达水平与肿瘤大小(P=0.046)、BCLC分期(P=0.030)、微血管侵袭(P=0.046)相关；Kaplan-Meier生存曲线示：高表达IL-37的HCC患者总生存期和无病生存期均高于低表达IL-37的HCC患者（中位总生存期46.0个月VS25.0个月，P=0.011；中位无病生存期29.0个月 VS17.0个月, P=0.007）；单因素COX回归分析示：影响HCC总生存期的危险因素是组织学分级(P=0.009)， BCLC分期(P=0.033)，微血管侵袭(P=0.030)和IL-37表达水平(P=0.013)；影响HCC无病生存期的危险因素是肿瘤大小(P=0.023)，组织学分级(P=0.005)，BCLC分期(P=0.017)，微血管侵袭(P=0.009)和IL-37表达水平(P=0.009)；多因素COX回归分析示：影响HCC总生存期的独立危险因素是组织学分级(P=0.017)和IL-37表达水平(P=0.050)；影响HCC无病生存期的独立危险因素是组织学分级(P=0.010)、微血管侵袭(P=0.046)和IL-37表达水平(P=0.045)；qRT-PCR、Western-blot结果示：HCC细胞系中IL-37的表达水平显著低于正常肝细胞；CCK-8和克隆形成实验显示：与对照组（LV_NC）相比LV_IL1F7组可显著抑制人HCC细胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；与对照组（Si_NC）相比Si_IL1F7可显著促进人HCC细胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；细胞凋亡实验结果显示：过表达或者沉默IL-37的表达不能影响HepG2、SMMC7721细胞的凋亡（P＞0.05）；细胞周期实验结果显示：LV_IL1F7可诱导HepG2、SMMC7721细胞G2/M期阻滞，Si_IL1F7则降低HepG2、SMMC7721细胞G2/M期阻滞（P＜0.05）；Western-blot结果显示：与对照组相比， LV_IL1F7可显著抑制HepG2、SMMC7721细胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表达，同时上调p21的表达（P＜0.05）；与对照组相比，Si_IL1F7可显著促进HepG2、SMMC7721细胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表达，同时下调p21的表达（P=0.05）。 结论：HCC中低表达IL-37与HCC的临床病理特征及预后密切相关，并通过诱导HCC细胞阻滞于G2/M期抑制HCC细胞增殖，其机制与促进肿瘤细胞上调c-myc，cdc2，cyclinB1，下调p21的表达有关。 第三部分：IL-37通过TGF-β/Smad3的磷酸化信号转换抑制HCC细胞增殖的作用及分子机制研究。 目的：深入探讨和分析TGF-β/Smad3信号通路在IL-37抑制HCC细胞增殖的作用及分子机制，并在体内实验中验证体外实验结果。 方法:Western-blot分析过表达IL-37与沉默 IL-37后， Smad3、pSmad3C、pSmad3L的表达；用含有TGF-β的培养基培养pSmad3C磷酸化抑制剂SIS3预处理的 SMMC-7721细胞，观察过表达IL-37对pSmad3C、pSmad3L、c-myc、p21的表达影响；用含有TNF-α的培养基培养JNK磷酸化抑制剂SP600125预处理的SMMC-7721细胞，观察过表达IL-37对pSmad3C、pSmad3L、c-myc、p21的表达影响，并用ELISA法检测细胞上清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表达；CCK-8实验检测经 TGF-β预处理的 LV_IL1F7-SMMC-7721细胞及LV_NC-SMMC-7721细胞的增殖情况；构建裸鼠皮下成瘤动物模型，在体内观察LV_IL1F7-SMMC-7721组与LV_NC-SMMC-7721组裸鼠肿瘤增殖的差异；Western-blot检测皮下种植瘤pSmad3C、pSmad3L、p21、c-myc、cdc2、cyclinB1的表达水平；ELISA法检测裸鼠血清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表达；IHC检测101例HCC及其癌旁组织中pSmad3L的表达，并分析其与IL-37表达的相关性；Kaplan-Meier生存曲线分析pSmad3L表达与HCC临床病理特征及预后的相关性。 结果：与对照组相比，过表达IL-37，对Smad3表达无影响，但可显著抑制pSmad3L的表达水平，上调pSmad3L的表达，沉默IL-37则可促进 pSmad3L的表达水平，抑制 pSmad3C的表达；TNF-α处理SMMC-7721LV_NC细胞可激活pSmad3L/c-myc信号，抑制pSmad3C/p21信号，但SMMC-7721LV_IL1F7细胞中pSmad3L/c-myc信号表达受到抑制，而pSmad3C/p21信号表达显著增强；过表达IL-37对JNK以及pJNK的表达无影响；与对照组相比， JNK抑制剂 SP600125预处理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7细胞后，再加TNF-α处理细胞， pSmad3L/c-myc信号表达受到抑制，而pSmad3C/p21信号表达显著增强；TGF-β处理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7细胞，pSmad3C/p21信号表达均显著增强，但SMMC-7721LV_IL1F7与对照组SMMC-7721LV_NC相比，pSmad3L/c-myc信号表达仍受到抑制；用TGF-β1依赖的Smad3磷酸化特异性抑制剂SIS预处理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7细胞，再用TGF-β处理各组细胞，SMMC-7721LV_IL1F7组pSmad3L/c-myc信号表达受到抑制，但SMMC-7721LV_NC组pSmad3C/p21信号表达无变化， ELISA检测细胞培养上清结果示：SMMC-7721LV_ IL1F7组与SMMC-7721LV_NC组相比，TGF-β表达水平明显升高，IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表达水平显著下降；CCK-8实验示：SIS预处理，可减弱 IL-37对肿瘤增殖的抑制作用；裸鼠成瘤实验结果证实：SMMC-7721LV_IL1F7组，皮下种植瘤的体积（P=0.02），重量（P=0.004）显著小于对照组；WB结果示：SMMC-7721LV_IL1F7组pSmad3L/c-myc, Cyclin B1, cdc2的表达显著下调，pSmad3C/p21的表达显著上调；ELISA结果示：SMMC-7721LV_IL1F7组与对照组相比，TGF-β表达水平明显升高IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表达水平显著下降；IHC结果示：IL-37与pSmad3L的表达呈负相关（r=-0.3315,P=0.0007）, Kaplan-Meier生存分析结果示：高表达pSmad3L的患者OS， DFS时间均低于低表达pSmad3L的患者。 结论：IL-37是 JNK/pSmad3L/c-Myc信号的直接抑制剂，可促进JNK/pSmad3L/c-Myc致癌信号向pSmad3C/p21抑癌方向转换，进而抑制HCC细胞增殖。本研究非可控性炎症恶性转换中的分子机制提供了新的理论基础，为HCC的治疗提供了新的治疗靶点。