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破骨细胞抑制性凝集素(OCIL)是近年来新发现的一种重要的破骨细胞抑制因子。大鼠OCIL是一种由233个氨基酸组成Ⅱ型跨膜C型凝集素,其组织分布与RANKL/OPG系统非常相似。体外研究表明OCIL可以剂量依赖方式减少由RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞样细胞的生成,抑制骨吸收陷窝的形成,但它并不能象OPG那样中和RANKL,提示OCIL对破骨细胞分化的阻断作用可能是直接的。鉴于OCIL强烈抑制破骨细胞分化的功能,科学家预测它有可能开发为骨质疏松防治药物。但是目前OCIL抑制破骨细胞分化和骨吸收的机制还不清楚,它不能中和RANKL,也不影响(?)RANKL/OPG的表达水平。另外,PGE2、1,25(OH)2D3、PTH和维甲酸等可显著上调成骨细胞中OCIL的表达,但具体的调节机制目前尚未阐明。为此,本文分三部分对成骨细胞中OCIL基因的表达调控机制和OCIL抑制破骨细胞发育的分子机理进行了探究。第一部分,我们进行了有关PTHrp对成骨细胞中OCIL基因表达的调节及其分子机制的研究。我们利用Real-time PCR技术研究发现PTHrp(1-34)以剂量和时间依赖的方式促进UMR106成骨细胞样细胞中OCIL mRNA的表达,而且PTHrp(1-34)对OCIL mRNA表达调节的起始和达高峰的时相均晚于PTHrp(1-34)对RANKL的诱导和对OPG的抑制。另外我们还通过Western blotting分析证实：PTHrp(1-34)能轻度促进小鼠MC3T3-E1细胞中OCIL蛋白的表达。为进一步明确何种信号通路介导了PTHrp(1-34)诱导的大鼠成骨细胞OCIL基因表达,我们采用不同信号通路的激动剂和阻断剂处理细胞,运用实时荧光定量PCR技术检测OCIL mRNA的表达水平。结果发现：RNA合成抑制剂放线菌素D几乎能够完全取消PTHrp(1-34)引发的OCIL mRNA表达；而蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX明显上调PTHrp诱导的OCIL表达,但较CHX单独作用引起的OCIL mRNA水平升高呈现出降低的趋势。我们还证实：cAMP/PKA信号通路激动剂PTH(1-31)、FSK和db-cAMP均促进OCIL mRNA的表达；钙离子载体A23187也能显著诱导OCIL的表达；而相比之下PKC信号通路激动剂PMA短时间作用减弱OCIL的表达,长时间作用诱导OCIL的表达。而特异性的PKA抑制剂KT5720、MAPK抑制剂PD98059、钙调蛋白抑制剂W-7和钙调蛋白激酶抑制剂KN-62均能明显阻断PTHrp诱导的OCIL表达。另一方面,PKC信号通路抑制剂chelerythrine能明显上调PTHrp(1-34)诱导的OCIL mRNA表达。而且,PD98059能够阻断db-cAMP诱导的OCIL表达,但它对A23187诱导的OCIL水平增高没有影响。这些结果说明在细胞水平,PTHrp(1-34)能够促进OCIL的表达；cAMP/PKA, Ca2+/CaMK Ⅱ和MAPK信号通路参与了PTHrp(1-34)对OCIL基因诱导表达的调节。第二部分,为深入研究成骨细胞中OCIL基因表达调控的分子机制,鉴定调控OCIL基因表达的转录元件,我们将大鼠OCIL基因5’旁侧区长约4.5Kbp(-4370-+118bp)的DNA片段,克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic的上游,并瞬时转染入三种内源OCIL mRNA表达水平不同的细胞,即大鼠UMR106成骨细胞系、原代大鼠成骨细胞和大鼠脑胶质瘤C6细胞系,结果发现三种细胞荧光素酶活性水平的差异与这三者中OCIL mRNA水平的差异一致,说明大鼠OCIL基因的表达调控主要发生在转录水平。在此基础上我们构建了大鼠OCIL启动子报告基因载体的5’端系列缺失体,通过转染实验发现：这些启动子缺失体具有不同程度的转录活性,由此我们初步确定了OCIL基因最小启动子序列和OCIL启动子上可能存在重要调节元件的区域。为下一步寻找和鉴定OCIL基因启动子中PTHrp的反应区域和核心应答元件奠定了良好的基础,同时也为今后深入研究PTHrp或其它骨代谢调节因子对OCIL基因表达的调控机制提供了一个方便、有力的研究手段。第三部分,我们首先使用本室原有已构建的含小鼠OCIL基因cDNA全长序列的pMal/mOCIL质粒为模板,经PCR扩增获得小鼠OCIL基因的编码序列。而后以化学合成的Igk+的信号肽序列和nOCIL为模板,利用二者间互补的18个碱基,经过重叠延伸PCR使二者拼接为融合基因。接下来,将融合基因sig-mOCIL克隆入真核表达载体pcDNA3.1,重组表达载体转染CHO细胞,G418加压培养筛选稳定表达细胞。进行基因整合鉴定后用整合有pcDNA3.1/sig-mOCIL的CHO细胞条件培养基干预PTHrp诱导培养的小鼠骨髓细胞,发现：重组OCIL蛋白对PTHrp诱导的破骨细胞样细胞生成和破骨细胞特异性基因TRAP、MMP-9、CTSK mRNA的表达增高有明显的抑制作用,提示OCIL基因可能通过影响TRAP、MMP-9、 CTSK mRNA的表达来抑制破骨细胞分化和活性。本实验为今后进一步深入研究OCIL影响破骨细胞发育和功能的分子机制奠定了基础。